小麦染色体ba文库构建技术优化及小麦抗逆相关基因分子鉴定.pdfVIP

摘 要 anifidal 细菌人工染色体文库(bacIcrialchrom∞n”，BAC)在基因组物理图谱构建、基因组测 序、基因图位克隆以及基因结构和调控研究等方面发挥了巨大作用。本研究以普通小麦中国春端体 mole“lar 5DL为材料，通过对染色体流式分选技术、从分选染色体中获取高分子量(high wcigh‘ BIBAc)构建技术优化，以完善小麦染色体 HMw)DNA及双元细菌人工染色体文库(binaIyBAC 特异文库构建技术体系。取得以下研究结果： 1、普通小麦中国春端体5DL根尖细胞周期同步化：经1．25 理18 h，随之进行6h的恢复处理可将85％以上的细胞同步化，随后再经1ⅣM氟乐灵(砌u删Iin) 处理2．5h，60％以上细胞被阻断在中期。 2、高质量染色体悬液制各结果：同步化的根尖细胞经2％多聚甲醛固定20m．m，机械匀浆释放 染色体并结合10％及30％蔗糖浓度梯度纯化释放的染色体悬液。利用该方法可获得染色体结构完整、 细胞碎片含量少、背景清晰的染色体悬浮液，适合于流式核型分析。 3、普通小麦中国春端体5DL的流式核型分析：结果表明普通小麦中国春端体5DL的流式核型 除具有普通小麦的4个峰外(复合峰I、II、珊及染色体3B)，还存在一个额外峰。 4、染色体5DL分选及鉴定：将中国春端体5DL流式核型图中额外峰染色体分选，采用特异的 bp的特异条带，同时结合对分选来自额外峰 微卫星引物裾¨174进行PcR，结果可得到一条233 染色体镜检观察，表明分选的染色体正是端体5DL． 5、从分选染色体中获取}蹦wDNA．对复合峰染色体设门分选，并经2uBⅢm酶切3．10min， 可得绝大部分为50-300kb的}玎删DNA。 6、BmAC载体容载能力检测：随机抽提50个克隆进行肌讲完全酶切，插入片断大小可达100 kb左右． 通过上述技术优化，初步建立了适合进行小麦染色体特异文库构建的技术体系。 干旱、高盐及低温是影响作物生长的三种主要非生物胁迫因子。Na+液泡内区域化是植物特别是 盐生植物适应Na+毒害非常有效的手段，液泡型Na+脯逆转蛋白在这一过程中起重要的作用。本研 究对Na+／}r逆转蛋白及与逆境胁迫相关的激酶∞P硌、MAP凡的相关分子生物学功能进行鉴定， 结果如下： 1、小麦Na诅+逆转蛋白基因表达特性分析：根据Na佃+逆转蛋白基因序列设计引物进行半定 量期：PCR，结果表明小麦Na恤r转运蛋白在植物体内表达量与干旱、高盐及低温胁迫有关，而与 ABA无关。 构域分析表明其存在n个跨膜结构域。 II 白亚细胞定位分析，结果表明N湘+逆转蛋白主要定位在液泡膜上。 4、依赖于钙离子的蛋白激酶(calcim．dependcntpmtcjn 与干旱、高盐、低温及ABA诱导皆有关。 5、④PKl及分裂原激活的蛋白激酶(1nitogen．adiv砒edkina辩s，MAPl(s)原核诱导表达： p∞蕾cin 将a)跚及肛怛妇基因全长构建到原核表达载体pGEx州：1，诱导其在原核宿主菌内表达，结果 诱导将为下一步进行激酶激活功能验证做准备。 本研究通过对与抗逆相关基因几个方面的分子生物学功能鉴定，将在一定程度有助于理解一些 小麦品种抗旱、耐盐及耐低温的分子机制，为小麦抗逆育种提供理论参考。 关键词：染色体分选，BmAc文库，流式核型，Na+m+逆转蛋白，表达模式 III Abstract B批枷aIti矗cial for血c∞船tnlcIi蚰of dlID脚∞蛳s∞A哟啦widcly咐d physⅫ蚴ps柚d forthewhok