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高效液相色谱法分类(按分离机制) 液固吸附色谱法 (LSAC) 液液分配色谱法（LLPC) 离子交换色谱法 (IEC) 离子对色谱法 (IPC) 分子排阻色谱法(SEC) :又叫做凝胶色谱法,分子筛色谱法,尺寸排阻色谱法. 应用 广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 二 :分离原理:(存在几种) 立体排斥理论 有限扩散理论 流动分离理论 分子热力学理论和二次排斥理论等 由于用立体排斥理论解释凝胶色谱中各种分离现象与事实一致,因此被广泛采用。 立体排斥理论 分离基础主要依据溶液中分子体积大小进行分离 不同尺寸的高聚物分子分离示意图: 流路系统 常用的流动相 四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝胶渗透色谱）；水（凝胶过滤色谱）等。 水为流动相: 适用于水溶性样品，有机溶剂流动相: 适用于非水溶性样品。 例子二:GFC法测定芪参多糖的分子量分布 色谱条件和试剂: 色谱柱：Polysep-GFC –P 4000 (300×7.80mm, Phenomenex ) 流动相：纯化水 PL-ELS 2100蒸发光散射检测器 色谱工作站：英谱 HS色谱数据工作站（带GPC软件） 标准分子量多糖(麦芽糖) :Shodex Standard P-82 系列(昭和电工 ) HPGPC标准分子量拟合曲线(二级曲线) 多糖样品的色谱图 三批芪参多糖分子量及其分布测定结果 结论: 芪参多糖中主要含有分子量为3000左右(TR=17.160min)和130万(TR=12.127min)的多糖组分 例子一：头孢曲松钠中聚合物的检查(药典规定方法) 聚合物峰 分子量130万 分子量3000左右 2756 46.05 组分2 1.34E+06 53.24 组分1 060503p 2847 44.89 组分2 1.20E+06 51.52 组分1 060502p 2331 44.21 组分2 1.13E+06 50.92 组分1 060501p 重均分子量（Da) 归一化百分含量（%） 产品批号 * * 第六节 分子筛色谱法(SEC ) Size-Exclusion chromatogrphy 定义:是以化学惰性的多孔性物质作固定相，溶质分子不是与固定相发生相互作用，而是受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。 固定相是有一定孔径的多孔性填料(凝胶,微孔硅胶,玻璃珠等) 流动相是可以溶解样品的溶剂 小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。 一、概述 根据流动相分类: 流动相为有机溶剂：凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography GPC):常用葡聚糖凝胶LH-20 流动相为水：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC） 分析样品： 多肽、蛋白质、核酸、多糖、生物大分子、高聚物、组织提取物等 大分子不能进入凝胶孔洞而被完全排除，只能沿着凝胶颗粒之间的空隙通过色谱柱，最先被流动相洗脱出来。 小分子能进入凝胶的绝大部分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢地被洗脱出来。 中等大小分子只能进入凝胶中一些适当的孔洞中，受到部分渗透作用,所以在柱中受到的滞留作用介于大分子与小分子之间。. 溶解样品的溶剂分子，分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出。 保留体积 VR＝Vm+Kd·Vs 溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数 二、分离原理 当VR＝Vm，Kd＝0： 说明溶质完全不进入凝胶内部，此现象称为全排斥，此也为凝胶的排阻极限。 溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数Kd 当VR＝Vm+Vs，Kd＝1： 说明溶质完全进入凝胶内部，此现象称为全渗透，此也为凝胶的渗透极限。 溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数Kd 大部分溶质：0Kd1 排阻极限 （Kd＝0） 渗透极限 （Kd＝1） vi 进样阀 泵 ELSD检测器 废液 GPC或者GFC柱 工作站 样品溶液 1）分离时间短，溶质谱带窄,易于检测； 可以使用灵敏度低的监测器; 优点： 2）根据分子大小，可预测分离；时间； 3）分离过程中无样品损耗和反应发生； 优点： 4）柱几乎不失活，寿命长； 5）特别适用在未知样品的探索分离 缺点： 不能分辨分子大小相近的化合物,分子量大小相差大于10%才能得以有效分离! 葡聚糖凝胶 三、固定相 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 二乙烯基苯型凝胶 多孔玻璃凝胶,多孔硅胶 软质凝胶，不耐压：中、低压色谱 硬质凝胶，耐压 半硬质凝胶 1. 对样品的溶解性好 四、流