最新第八讲 酶工程在医药工业中的应用.pptVIP

主要讲授内容 一、固定化酶(细胞)的制备 二、固定化酶(细胞)的性质和指标 三、固定化酶和固定化细胞的反应器 四、酶工程在医药工业中的应用 酶促反应的专一性强，反应条件温和。酶工程的优点是工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小，而且产品收率、纯度高，还可制造出化学法无法生产的产品。以下重点介绍固定化酶技术在制药工业中生产抗生素、核苷酸和氨基酸的应用。 1. 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 2. 固定化酶法生产5’-复合单核苷酸 3. 固定化酶法生产L-氨基酸 1. 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 青霉素G (或V)经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸(6-APA)，也称无侧链青霉素。 6-APA是生产半合成青霉素的最基本原料，到目前为止，以6-APA为原料已合成近3万种衍生物，并已筛选出数十种耐酸、耐酶、低毒及具有广谱抗菌作用的半合成青霉素。 1．技术路线 固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸的技术路线 2．工艺过程 (1) 大肠杆菌培养 (2) E．coli 固定化 (3) 固定化E．coli反应堆制备 (4) 转化反应 (5) 6-APA的提取 青霉素酰化酶转化流程图 1. 酶反应器；2．pH凋节罐；3．热水罐；4．碱液罐； 5. 热水循环泵；6．裂解液循环泵； 7．流量计； 8. 自动pH计；9．自动记录温度计；10．酶反应器温度计 大肠杆菌培养 斜面培养基：普通肉汁琼脂培养基； 发酵培养基：蛋白胨2％，NaCl 0.5％，苯乙酸0.2％，自来水配制。用2mol/L NaOH 溶液调pH 7.0，在55.16 kPa压力下灭菌30 min后备用。 将斜面接种后培养18～30 h的E．Coli D816 (产青霉素酰化酶)，用15 mL无菌水制成菌细胞悬液；取1 mL悬浮液接种至装有30mL发酵培养基的三角烧瓶（250 mL）中，在摇床上28℃，170 r/min振荡培养15 h，如此依次扩大培养，直至1 000～2 000 L。 规模通气搅拌培养。培养结束后用高速管式离心机离心收集菌体，备用。 E．coli 固定化 取E. coli 湿菌体100 kg，置于40℃反应罐中，在搅拌下加入50 L 10％明胶溶液，搅拌均匀后加入25％戊二醛5L，再转移至搪瓷盘中，使之成为3～5cm厚的液层，室温放置2 h，再转移至4℃冷库过夜； 待形成固体凝胶块后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2 mm左右的颗粒状固定化E．coli细胞，用蒸馏水及pH7.5、0.3 mol/L磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，备用。 固定化E．Coli 反应堆制备 生物反应堆：将酶或细胞进行固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反应器中制成的填充式反应器。 将上述充分洗涤后的固定化E．Coli 细胞(产青霉素酰化酶)装填于带保温夹套的填充床式反应器中，即成为固定化E．coli 反应堆（反应器规格为Ф70 cm×160 cm）。 转化反应 取20 kg青霉素G(或V)钾盐，加入到1 000 L配料罐中，用0.03 mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素钾盐浓度为3％，用2mol/ L NaOH溶液调pH至7.5～7.8； 然后，将反应器及pH调节罐中反应液温度升到40℃，维持反应体系的pH在7.5～7.8范围内，以70 L/min流速使青霉素钾盐溶液通过固定化 E．Coli 反应堆进行循环转化，直至转化液pH不变为止。循环时间一般为3～4 h。反应结束后，放出转化液。 6-APA的提取 上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100L左右；冷却至室温后，于250 L搅拌罐中加50 L 醋酸丁酯充分搅拌提取10～15 min（萃取）； 取下层水相，加1％ g/mL活性炭于70℃搅拌脱色30 min，滤除活性炭；滤液用6 mol/L盐酸调pH至4.0左右，5℃放置结晶过夜；次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115℃烘2～3h，得成品6-APA。按青霉素G计，收率一般为70％～80％。 2. 固定化酶法生产5’-复合单核苷酸 4种5’-复合单核苷酸注射液可用于治疗白血球下降、血小板减少及肝功能失调等疾病。核糖核酸(RNA)经5’-磷酸二酯酶作用可分解为腺苷、胞苷、尿苷及鸟苷的一磷酸化合物，即AMP、CMP、UMP，及GMP。 5’-磷酸二酯酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞及麦芽根等生物材料中。 实验以麦芽根为材料制取5’-磷酸二酯酶，并使其固定化后用于水解酵母RNA，以生产5’-复合单核苷酸注射液。 RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子 核苷酸之间的连结方式：3‘,5’-磷酸二酯键 1．技术路线 固定化酶法生产5’-复合单核苷酸的技术路线 2．工艺过