家蚕中肠和培养胞的蛋白质组学研究.pdfVIP

摘 要 利用双向电泳和基质辅助激光解析飞行时间质谱结合的蛋白质组学技术对家 蚕5龄期不同发育时期的中肠蛋白质组进行了比较研究；通过多维液相色谱和串 联质谱联用的蛋白质组学技术对5龄期第2天家蚕幼虫的中肠蛋白质组组成进行 了分析，通过一维电泳、多维液相色谱分离技术以及串联质谱结合的方法对 BmNPV感染前后的家蚕BmN培养细胞的蛋白质组组成进行了另’祈研宄，譬比亡 们之间的差异性。在此基础上通过生物信息学分析和分子生物学技术对通过蛋白 质组学鉴定的2种抗病毒蛋白的分子生物学特征以及抗病毒活性进行了分析和研 究。主要结果如下： 1、对家蚕5龄期第2天、第5天和第7天的中肠组织蛋白质进行了2D电泳， 2D Platinum对蛋白图 建立不同时期标准的蛋白质参考图谱。利用ImageMaster kDa 谱进行分析，发现家蚕中肠蛋白质大多分布在pI值4二8、分子量20—70 的区域。5龄期家蚕第2天的蛋白质斑点数目为869个，第5天为966个，新增 KDa区间；进 6—9，分子量20--40 蛋白数目97个，增加的蛋白主要分布在pI 入幼虫成熟期(第7天)的蛋白质斑点数目明显减少，仅为420个，斑点数减 少了56．5％。利用MALDI．TOF．MS对差异表达的部分蛋白质斑点进行鉴定，发 现在5龄期初期和旺食期(第2天和第5天)，表达量较大的蛋白主要是由家蚕 中肠的肌肉层和上皮层的结构蛋白，与中肠消化和吸收功能相关的蛋白以及与 家蚕细胞凋亡相关的蛋白组成，它们分别是肌动蛋白、胞质型肌动蛋白A3al、 微管蛋白0【．8链、角蛋白1、热激70kDA蛋白类似物3、液泡性ATP合成酶催 化单位A、硫醇抗氧化蛋白、AGLl65Wp、精氨酸激酶等、血淋P．30k蛋白r莘 因6G1)和主要血浆蛋白30k等。这些蛋白大多数在家蚕5龄期末期表达量下 降，甚至完全降解，除液泡性ATP合成酶催化单位A以外。液泡性ATP合成 酶催化单位A表达量上升可能和家蚕中肠5龄期末期需要大量的能量降解家蚕 中肠本身的组织蛋白，从而尽快消化失去生物功能的家蚕中肠组织有关。 2、为了进一步详细解析中肠蛋白质组的组成并解释中肠的生物学功能。利用 ●● 纳米液相色谱电喷雾串联质谱分析了家蚕中肠的蛋白质组，获得的质谱数据利用 X!Tandem搜索软件通过不同的参数进行分析，并且通过泊松模型进行确认，最终 共获得90个蛋白点。其中79个蛋白点被首次描述，发现22个蛋白点与中肠的消 化功能密切相关，包括中肠上皮细胞分泌的11种酶，肠壁肌肉所需要的8种驱动 蛋白和防止食物摩擦肠壁受伤的3种围食膜蛋白；44种蛋白与物质和能量的代谢 相关；11种蛋白与信号转换、物质运输以及细胞骨架相关。 3、利用一维SDS凝胶电泳和串联质谱连用的方法研究家蚕培养细胞BmN 蟹白质组的组成，鉴定到1478种的蛋白质，通过GO分类注释发现，这些蛋白 具有不同的等电点和分子量，含有多种不同的生物活·巨，像催化活性、结合活 性、分子转导活性、动力活性、转录调节活性、酶调节活性以及抗氧化活性。 利用相同的方法研究BmNPV感染后BmN培养细胞蛋白质组组成，鉴定的蛋白 质数目为303个，通过对比发现，感染后新出现的特异蛋白点数目有8个，分 别是微管蛋白13-1，脂肪酶，丝氨酸蛋白酶2，ICE．5蛋白，网格蛋白，鸟氨酸 结合蛋白，凋亡蛋白激活因子以及另外一个未知的蛋白。在这些蛋白中，网格 蛋白、微管蛋白13-l和病毒的侵染途径有关；脂肪酶、丝氨酸蛋白酶以及鸟氨酸 结合蛋白和抗病毒相关；而ICE．5蛋白、凋亡蛋白激活因子和家蚕Bran细胞凋 亡相关，最后一种蛋白的功能未知。 4、对上述发现的抗病毒蛋白进行了进一步分析，从中国家蚕和野蚕幼虫中