蛋白酪氨酸磷酸shp-1shp-2催化活性域的底物特异性研究.pdf

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1／SHP-2催化活性域的 底物特异性研究 摘要 有55％的同源性，SHP-I／SHP-2在机体内却各自具有不同的生物学功能： SHP一1主要在造血细胞和上皮细胞中表达，在信号转导中主要起负调控作 用；而SHP-2贝,iJ在各种类型的细胞中都有表达，在信号转导中主要起正调控 细胞信号转导通路的选择，进而对细胞间通信、细胞生长和增殖、细胞周 物中选择各自的特异性底物，并发挥其相应的生物学功能的机制至今未见 有详实的报道。此问题引起了相关领域研究人员的极大关注口 化活性域的B 6区域内存在3个有区别的氨基酸残基，对 5-loop-B Y5／Y6和SPAP2aYI-Y4蛋白为反应底物，来分 表达纯化的单磷酸化位点PZR 性底物；并进一步揭示SHP一1／SHP一2催化活性域B5-loop—B6区域内3个有 区别的氨基酸残基对DIC／D2C底物特异性的影响。 及其各突变体的菌株，经IPTG诱导表达、菌体裂解缓冲液悬浮和超声波破 碎后，通过HPLC分离纯化D1C／D2C及其各突变体的蛋白，所得产物进行 蛋白。 其次，对DIC／D2C及其各突变体蛋白的酶动力学特性进行初步探讨，为 后续的底物特异性研究奠定了理论基础。试验中以PY作为去磷酸化反应的 底物，利用孔雀绿显色法，通过双倒数作图法对纯化的D1C／D2C及其各突变 磷酸酶活性要高于D2C／D2C3M约1．5—2倍。 然后，为了获得单磷酸化的PZR 的底物特异性分析。本试验以His-PZR原核表达载体为模板，利用特异的点 突变引物，经PCR重叠延伸法扩增获得单磷酸化位点的PZRY5／Y6片断，并 分别构建其相应的原核表达载体。构建好的重组质粒与C-Src原核表达载体 共转化大肠杆菌BL。。菌株，并通过IPTG诱导目的蛋白表达，表达产物进行 破碎后，经Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化单磷酸化的PZRY5／Y6蛋白。所得纯化产 异性分析。结果表明：(1)已成功地表达了单磷酸化的PZRY5／Y6蛋白，分 变，催化活性较D2C强，介于DIC和D2C之间。 体的底物特异性分析。本试验分别以GST-SPAP2aYI-Y4原核表达载体DNA为 模板，利用含6×His—Tag融合标签的突变引物，经PCR扩增获得含6× Y1-Y4片断，并分别构建其相应 His-Tag融合标签的单磷酸化位点的SPAP2a 的原核表达载体。构建好的重组质粒与C-Src原核表达载体共转化大肠杆菌 BL：。菌株，并通过IPTG诱导目的蛋白表达，表达产物进行SDS和 经 Western-Blot检测。检测的表达菌体利用裂解液悬浮和超声波破碎后， 明：(1)已成功地表达了含6 白，分子量大小为16．8KD，且蛋白均以可溶性的方式进行表达。(2)磷酸 化的SPAP2a Y3是D2C的 Y1、Y2和Y4是DIC的特异性底物，磷酸化的SPAP2a 特异性底物。(3)以SPAP2a Y2为底物，D2C3M在一定的程度上实现了底物 Y3 为底物，D1C4M在一定的程度上实现了底物特异性的转变，催化活性较DIC 强，介于DIC和D2C之间。 综上所述，本课题已顺利完成了对DIC／D2C单磷酸化特异性底物的确证， 及对B 6区域内3个有差异的氨基酸残基对于底物特异性影响的 5-100p-13 机制，及日后选择特异性底物用于生成酶一底物复合晶体提供了理论依据； 同时，也为进一步研究蛋白酪氨酸磷酸酶SHPs在细胞信号转导通路中的生 物学作用及调控机制奠定基础。 PZR；SPAP2a 酸化的酪氨酸(PY)； S