TGF-beta;_Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(12):2460-2468 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.019 TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌 卫星细胞增殖过程中的作用机制 林 凯，虞德兵，解晓东，于敏莉，李东锋，杜文兴 （南京农业大学动物科技学院遗传育种实验室，南京 210095 ） 摘要：【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积，可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟 采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞，阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭 骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化 14 d 的鸭胚为试验材料，采用差速贴壁的方法分离骨骼 肌卫星细胞，待细胞长到70%—80%时，将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL-1 的Follistatin培养 基，继续培养36 h后，采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况；使用抗pax7抗体染色，DAPI染核，鉴定骨骼 肌卫星细胞；采用 real-time qPCR 方法检测 Follistatin 对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因 PCNA、生肌 因子基因MyoD 和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察，传代 培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形，一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁，细胞略有变长。2 d后 细胞继续增多，且呈长梭形。3 d后细胞数目增加，个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加，细胞变粗，个别 细胞融合。5 d 后有少量细胞开始分化，细胞进一步融合。Pax7 免疫荧光染色分析显示，95%以上的细胞中 Pax7 呈阳性表达；CCK-8 检测细胞增殖分析表明，不同浓度的 Follistatin 处理鸭骨骼肌卫星细胞后，各处理组细胞 增殖均显著高于对照组( -1 P ＜0.01)，且10 ng·mL Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显，为最佳处 理浓度；与对照组相比，10 ng·mL-1 Follistatin 处理组的 MyoD 基因表达量显著下降(P ＜0.05)，PCNA 基因表达 量显著升高(P ＜0.05)，Myf5 基因表达量显著升高，TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P ＜0.05)，且Smad3基因 表达量极限著升高(P ＜0.01)；Western blotting检测蛋白表达水平结果表明，与对照组相比，TGF-β、Smad2 和 Smad3 磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL-1 Follistatin 能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖，这一过程可 通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为 鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。 关键词：卵泡抑素（Follistatin）；骨骼肌卫星细胞；增殖；鸭 The Regulated Mechanism of Follistatin on the Proliferation Process of Duck Skeletal Muscle Satellite Cell Involved in TGF-β / Smad Signaling Pathway LIN Kai, YU De-bing, XIE Xiao-dong, YU Min-li, LI Dong-feng, DU Wen-xing （Laboratory of Genetics and Breeding, College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricult