不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库的构建与分析.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(11):2272-2280 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.021 不同发育时期花生胚混合全长cDNA 文库的构建与分析 1,2 1,2 1 1,2 1,2,3 1,2 陈 华 ，邓 烨 ，张 冲 ，蔡铁城 ，郑奕雄 ，庄伟建 1 2 3 （福建省作物分子与细胞生物学重点实验室，福州 350002 ； 福建农林大学作物科学学院，福州 350002 ； 仲恺农业工程学院，广州 510225 ） 摘要：【目的】深入了解花生胚发育的分子机制，获得花生胚发育相关基因。【方法】以优质花生品种闽花6 号为材料，分别取花生果针入土后10、20、30、40、50 和60 d （day after pegging，DAP ）的胚作为试验材料， 用CTAB 法提取花生胚总RNA，采用SMART （Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript ）技术合成双链 cDNA，经Sfi Ⅰ酶切后胶回收纯化双链cDNA，连接到质粒载体pDNR-LIB 上，电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞， 构建不同发育时期花生胚混合全长cDNA 文库，进行小规模测序。采用生物信息学分析手段对所获得的EST 进行功 6 能注释。【结果】构建了不同发育时期花生胚混合全长cDNA 文库，文库的库容为3.5 ×10 cfu/mL，重组率95.8%， 插入片段长度在500—2 000 bp，平均长度超过1 000 bp。随机挑取 60 个克隆进行5′端测序，共得到60 条高质 量的EST 序列，BLASTX 结果显示，有39 条序列（65% ）与GenBank 中大豆、花生、苜蓿等植物上已公布的序列有 较高同源性，其中，有 32 条具有已知或推测的功能，7 条序列功能未知。其余 21 条（35%）序列在NCBI 的非冗 余蛋白数据库中没有找到与之相匹配的序列，可能为花生新的EST 序列。利用BLAST2GO 对所得序列进行GO 注释 分析，结果表明，参与抗逆与防御、蛋白质合成与运输、油脂合成与代谢、转录与调控以及种子萌发、休眠、胚 发育相关的基因比较丰富，还有部分基因参与信号传导以及光形态建成等过程。KEGG 代谢途径分析表明，随机测 序所获得的序列中主要包括α-亚麻酸代谢和亚油酸代谢。【结论】利用SMART 技术成功构建了不同发育时期花生 胚混合全长cDNA 文库；小规模EST 测序分析获得了部分与花生胚发育相关的基因，如亚油酸9S-脂肪氧合酶、油 体蛋白、锌指蛋白、热休克蛋白90、胚胎发育晚期丰富蛋白、脂肪氧合酶以及DREB 转录因子等。 关键词：花生；胚；cDNA 文库；SMART 技术；表达序列标签 Construction and Analysis of a Full-Length cDNA Library of Peanut Embryos at Different Developmental Stages 1,2 1,2 1 1,2 1,2,3 1,2 CHEN Hua , DENG Ye , ZHANG Chong , CAI Tie-cheng , ZHENG Yi-xiong , ZHUANG Wei-