成肌细胞成脂过程中PPARgamma;、C_EBPalpha;和Myogenin 基因启动子的甲基化变化.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(14):3010-3021 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.017 成肌细胞成脂过程中PPAR γ、C/EBPα 和Myogenin 基因启动子的甲基化变化 姜美华, 巨婷婷, 刘 洋, 许 玲, 孙文娟, 赵泮峰, 尹靖东 （中国农业大学动物科技学院/动物营养学国家重点实验室，北京 100193） 摘要：【目的】利用C2C12 成肌细胞探讨肌源性干细胞成脂过程与调控成脂和成肌分化的关键转录因子PPAR γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）、C/EBP α（CCAAT/enhancer binding protein alpha） 和Myogenin 启动子区甲基化的关系。【方法】分别用2%马血清和三联诱导剂诱导C2C12 细胞成肌和成脂分化，在 马血清促进的成肌分化第0、1、3 和5 天收集细胞进行姬姆萨染色观察肌管形成情况；在三联诱导的成脂分化第 0、2、4、6 和10 天收集细胞进行油红O 染色观察脂滴形成情况；提取成肌诱导第0、1、3、5 天和成脂诱导第0、 2、4、6 天的RNA 和DNA，分别采用qRT-PCR 检测成肌和成脂分化相关基因的表达，采用重亚硫酸盐测序的方法检 测 PPAR γ、C/EBP α和Myogenin 启动子区甲基化的变化，并分析基因表达与甲基化状态的相关关系。【结果】① C2C12 细胞经马血清诱导形成了多核肌管，表达成肌相关基因，但不表达脂肪特异性基因；三联诱导使C2C12 细 胞自主分化的肌管中沉积了脂滴，同时表达成脂和成肌相关基因；②重亚硫酸盐测序结果表明，在未分化的成肌 细胞中，PPAR γ基因启动子的甲基化水平是61%，在三联诱导第2、4 和 6 天，其甲基化程度依次为49%、39%和 42%，呈逐渐去甲基化趋势，与PPAR γ基因转录负相关；在马血清诱导第3 和5 天，甲基化水平为56%和48%，与 未分化的成肌细胞相比差异不显著，同时PPAR γ基因的表达水平也没有显著变化；③Myogenin 基因在马血清促进 的成肌过程中甲基化水平不断降低（49%、42%、35%和 34%），转录水平急剧增加；在三联诱导过程中，Myogenin 启动子的甲基化水平由0 天的49%下降为第1 天的37%、第3 天的41%和第5 天的38%，但下降幅度弱于马血清诱 导的成肌过程，这一结果与降低的Myogenin 转录上调相吻合；④C/EBP α基因在未分化的C2C12 细胞中呈低甲基 化状态，甲基化程度仅为 1.6%，在成肌分化和脂肪沉积过程中均未发生显著变化，与基因表达无显著关联。【结 论】成脂和成肌关键转录因子PPAR γ和Myogenin 启动子区的DNA 甲基化变化参与了成肌细胞的分化和脂肪沉积 的调控。 关键词：C2C12 细胞; DNA 甲基化; 成肌分化; 脂肪沉积 Dynamics of PPARγ, C/EBPα and Myogenin Gene Promoter Methylation During Myoblasts Intracellular Lipid Accumulation JIANG Mei-hua, JU Ting-ting, LIU Yang, XU Ling, SUN Wen-juan, ZHAO Pan -feng, YIN Jing-dong (College of Animal Science and Technology, China Agricultural University/State Key Laboratory of Animal Nutrition, Beijing 100193) Abstract: 【Objective 】This experiment was designed to investigate whether DNA methylation of adipogenic promoters (pero