大豆（Glycine max）GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(18):3534-3544 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.18.002 大豆（Glycine max）GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能 1,2 3 2 1,2 4 2 2 徐东北 ，于月华 ，韩巧玲 ，马亚男 ，高世庆 ，田 野 ，徐兆师 ， 李连城 2 3 2 2 1 ，曲延英 ，马有志 ，陈 明 ，陈耀锋 1 2 （西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100 ； 中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学 3 4 与遗传育种重点开放实验室，北京 100081 ； 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052 ； 北京杂交小麦工程技术研究中心，北京 100097） 摘要：【目的】鉴定大豆抗逆相关转录因子 GmDREB5 的互作蛋白，分析其互作蛋白 GmUBC13 的特性及其生物 学功能，解析 GmDREB5 提高植物抗逆性的分子机制。【方法】通过酵母双杂交系统，以大豆GmDREB5 的AP2功能域 为诱饵对干旱处理的大豆cDNA文库进行筛选，获得GmDREB5 候选互作蛋白后通过酵母互作及体外Pull-down试验 确定 GmDREB5 与候选蛋白之间的互作关系；同时，分析互作蛋白 GmUBC13 的进化关系、蛋白结构及亚细胞定位等 特性；通过半定量RT-PCR分析其互作蛋白GmUBC13在干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理下的表达谱； 通过转化烟草鉴定 GmUBC13 的生物学功能。【结果】通过筛选大豆干旱处理的 cDNA 文库获得一个 GmDREB5 互作蛋 白 GmUBC13（ubiquitin conjugating enzyme 13），GmUBC13 属于泛素结合酶蛋白家族，GmUBC13 含有 UBCc 保守 域（ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain）、与泛素连接酶E3互作的氨基酸残基以及高度保守的半 胱氨酸催化位点。进化树分析表明，GmUBC13的氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana ）含有16个成员的 E2 家族的第 XV 亚组的 AtUBC13A、AtUBC13B 以及水稻（Oryza sativa ）的泛素结合酶蛋白 Os01g0673600 分别具 有 99%、97%和 97%的同源性。酵母互作试验及体外 Pull-down 分析证明 GmUBC13 与 GmDREB5 蛋白之间存在相互作 用。表达特性分析表明，GmUBC13 受干旱、高盐、低温等非生物胁迫和激素ABA处理的诱导表达。GmUBC13 在ABA 的胁迫条件下，1 h 开始有表达，10 h 时表达量上升到最大，24 h 稍微降低；在干旱和盐胁迫条件下，1 h 开始 表达，并随着胁迫时间的增长，表达量逐渐上升，24 h 表达量达到最大；在低温胁迫条件下，GmUBC13 受诱导较 快，5 h表达达到最大，在10 h和24 h时未表达。蛋白亚细胞定位结果显示，GmDREB5蛋白定位在细胞核和细胞 膜上，GmUBC13 定位在细胞核中。基因功能鉴定结果证明，过表达 GmUBC13 的转基因株系 GmUBC13-1、GmUBC13-2 和受体对照 W38 的幼苗在正常 MS 培养基上的生长状态基本相似，在不同浓度 PEG 胁迫条件下，转基因株系 GmUBC13-1、GmUBC13-2和W38 烟草叶片叶绿