生物检测技术——核酸探针摘要.pptVIP

生物检测技术 ——核酸探针 前言 从基因工程技术一开始，就伴随着核酸探针的应用。在许多领域如基因研究、SNP检测、STR检测、肿瘤研究、药理学研究等方面，核酸探针都是一种强有力的工具。为了能更好的应用和发展核酸探针，有必要对核酸探针有一个系统的认识。 核酸探针是以研究和诊断为目的，用来检测特定序列核酸(DNA 或RNA)的DNA或RNA片段，称为核酸探针，作为探针的核酸探针片段可以较短(20 bp)，也可以较(5kb)。 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。 核酸探针的标记物 一.放射性标记 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中，以32P应用最普遍。 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级；缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射性标记的探针。 二.非放射性标记 目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。 生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，运用原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。 核酸探针检测的原理 核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交，其工作原理是碱基配对，即2条碱基互补的DNA链(或2条碱基互补的DNA链和RNA链)在适当条件下可以按碱基配对原则，形成杂交DNA分子。 生物体含有相对稳定的DNA序列，不易受外界环境因素的影响而改变。一般来说同种生物的DNA序列相同，不同种生物体DNA序列不同．生物个体都有自己独特的DNA序列。根据中心法则．DNA双链的核苷酸分子是通过碱基之间的氢键作用力专一性互补配对而结合在一起的，每个基因的RNA和对应的模板DNA链也可以通过碱基配对而结合在一起。核酸探针就是根据核酸分子之间的互补配对原则设计的一种检测目标DNA序列是否存在的一段核酸序列。 核酸探针的分类及制备方法 根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为RNA探针、人工合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针等几类。 1） RNA探针 RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A(胰RNA酶)切比用Sl酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。 RNA的探针制备过程是将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段中某一适当部位或插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA，然后在相应的DNA依赖RNA聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。 2)人工合成的寡核苷酸探针 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下。由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针，长度一般长约10~30bp，甚至可达50 bp。如果已知核酸序列可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针，单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效；如果不知道核酸序列，可依据其蛋白质产物的氨基酸顺序推导出核酸序列从而合成DNA探针。 3)单链DNA探针和双链DNA探针 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合成单链cDNA探针。 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。 核酸探针的应用现状 一 食品检测中的应用：核酸探针技术已被用于检验食品中 一些常见的病原菌。 （1）大肠杆菌： 产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起