甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(7): 1351-1361 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.012 甜菜夜蛾UAP 的克隆、时空表达及RNAi 研究 陈 洁，陈宏鑫，姚 琼，张文庆 （中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275 ） 摘要： 【目的】在昆虫中，几丁质的合成对于其生长发育至关重要，虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比 较深入，但是在昆虫中，目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面，而对于通路上其他基因的研 究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的 UDP-N- 乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP ）对甜菜夜蛾 （Spodoptera exigua ）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。 【方法】以甜菜夜蛾5 龄第1 天幼虫的cDNA 为模 板，通过简并引物扩增出甜菜夜蛾 UAP 基因（SeUAP ）的中间片段，然后利用特异性引物和RACE 技术扩增出 3′ 和5′ race 序列，拼接得到cDNA 全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA，并通过RT-PCR 方法分析SeUAP 在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5 龄第1 天的幼虫注射dsUAP 观察其生长状况，检测RNAi 的 效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp 的SeUAP cDNA，编码一个491 个氨基 酸残基的蛋白，与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的 UAP 亲缘关系较近。该基因在表皮 和卵巢中大量表达，在气管和中肠中的表达次之，在马氏管中表达微弱，在脂肪体中则基本检测不到其转录本的 存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达，在卵的整个阶段、L22 （幼虫2 龄第2 天）、L31、L42、 L51、P0、P5、P7 以及A3 这些天中的表达量较高，其余天数表达量较低，其表达的高峰主要出现在几丁质需求量 较高的时期。RNAi 结果表明，通过向甜菜夜蛾5 龄第1 天的幼虫注射5 µg dsRNA，导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸 形及死亡，并出现两种畸形现象：（1 ）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化，但头部蛹壳形成有障碍，化蛹时无法 突破旧表皮；（2 ）虫体头部蛹壳形成正常，也能正常突破旧表皮，但蜕皮过程仅到此为止，无法正常进行下去。 定量PCR 结果显示SeUAP 的沉默对几丁质合成酶A 基因（SeCHSA ）下调不明显，而对几丁质合成酶B （SeCHSB ） 的表达有明显下调作用。【结论】UAP 可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一 定作用。 关键词：UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶；时空表达；甜菜夜蛾；RNA 干扰；几丁质合成 Molecular Cloning, Expression Patterns and RNAi of UDP-N-acetylglucosamine Pyrophosphorylase in Spodoptera exigua CHEN Jie, CHEN Hong-xin, YAO Qiong, ZHANG Wen-qing (State Key Laboratory of Biocontrol, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275) Abstract: 【Objective 】In insects, chitin biosynthesis is a key process for their growth and development. Although it has been studied deeply on fungi, little is known for other genes in the chitin biosynthesis pathway of insects, because most of