豌豆蚜温度受体基因Painless的克隆及时间和组织表达.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(19):3799-3809 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.008 豌豆蚜温度受体基因 Painless 的克隆及时间和组织表达 魏金金，曹德盼，杨 婷，王桂荣 （中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193） 摘要：【目的】从豌豆蚜（ Acyrthosiphon pisum ）触角中克隆候选的温度受体基因——Painless，分析该基 因所编码的蛋白结构特点，研究该基因在昆虫不同发育时期和不同组织中的表达谱，探讨该基因的功能。【方法】 通过生物信息学的方法，使用果蝇（Drosophila melanogaster ）Painless 从豌豆蚜基因组数据库 AphidBase 中 预测 ApisPainless 的假定全长序列，之后根据预测得到的假定全长序列，使用Primer premier 5.0 设计全长引 物，使用 RT-PCR 方法从豌豆蚜触角 cDNA 中克隆 ApisPainless 的全长序列，并应用 DNAMAN 软件对预测序列与克 隆序列进行比对，确定克隆序列与预测序列一致后，使用在线工具SMART （simple modular architecture research tool）对克隆得到的ApisPainless蛋白结构进行预测，分析其序列N端的锚蛋白重复序列及跨膜域，通过使用在 线比对软件Clustal Omega对ApisPainless与DmelPainless的3个可变剪切型（isoform A、B、C）进行多序列 比对，分析ApisPainless的可变剪切类型，通过构建昆虫TRP（transient receptor potential）离子通道超家 族的进化树，分析 ApisPainless 的进化地位，并通过绘图直观地比较 TRPA 亚家族 4 个成员 TRPA1、Painless、 Pyrexia和Water witch的序列长短及N端锚蛋白重复序列的差异，使用实时定量荧光PCR技术，研究ApisPainless 在1—4龄若虫以及成虫这5 个不同发育时期的相对表达量，以及其在豌豆蚜成虫的触角、头、足和胸腹这4个不 同组织中的相对表达量。【结果】预测并克隆得到 ApisPainless 全长序列，该基因的全长序列为2 832 bp，编码 943 个氨基酸，蛋白结构分析表明 ApisPainless 具有 8 个锚蛋白重复序列以及 6 次跨膜结构，通过序列比较发 现 ApisPainless 与 DmelPainless isform A 的相似性最高，达到 42.3%。进化树分析结果表明昆虫 TRP 超家族 分为 TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPV、TRPP 和 TRPML 7 个亚家族，而 ApisPainless 聚类于 TRPA 亚家族 Painless 一支，在 TRPA 亚家族 TRPA1、Painless、Pyrexia 和 Water witch 这 4 个成员中，TRPA1 的序列最长，约为 1 200 个氨基酸，其后依次是 Water witch、Pyrexia 和 Painless，氨基酸数目约有 920—1 000 个。从 N 端的锚蛋白 重复序列上看，Water witch 和 Pyrexia 约有 9 个重复序列，Painless 约为 8 个，而 TRPA1 则高达 15—16 个， 发育时期表达谱分析结果显示ApisPainless 在豌豆蚜的各个发育阶段均有表达，其中以1龄若虫期表达量最高。 组织表达谱分析结果显示，ApisPainless 在豌豆蚜的触角、头、足和胸腹各组织中均有表达，其中以在触角中 的表达量最高，足中的表达量居其次。【结论】克隆得到的ApisPainless 是 TRPA 亚家族 Painlss 基因，其在触 角及足中表达量高，推测其功能可能类似于果蝇的 Painless，参与