产琥珀酸丝状杆1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

本文是新疆维吾尔自治区科技厅科技支疆项目 “利用酵母工程菌创制新饲用酶制剂刀及 (项目编号：201191138) 新疆维吾尔自治区科技厅高技术研究发展项目 “瘤胃微生物非淀粉多糖水解酶基因资源的收集与利用砂 (项目编号：201211104) 的部分研究成果 课题主持人陈勇 (新疆农业大学动物科学学院) 万方数据 产琥珀酸丝状杆菌l，3．1，4．p．葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达 摘要 l，3．1，4．D．葡聚糖酶(EC3．2．1．73，以下简称为p．葡聚糖酶)是一种重要的工业用酶， 广泛的应用于饲料业、酿造业及纺织业。反刍动物瘤胃被认为是目前转化NSP效率最 高的生物反应器。其中，由产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter 聚糖酶在植物细胞壁的降解中起重要作用。但是由于其培养条件要求较苛刻，因此，不 能直接利用瘤胃细菌生产工业用酶制剂。本试验以瘤胃纤维降解菌产琥珀酸丝状杆菌D一 葡聚糖酶基因为研究对象，从基因密码子优化与表型表达两个方面提高表达量，并且研 究了重组酶的性质及体外效果评定的研究，为进一步的生产实践奠定基础。 试验选取产琥珀酸丝状杆菌p．葡聚糖酶成熟肽编码区，根据毕赤酵母密码子偏好性 对193个碱基进行优化，使GC含量由54％下降至44．2％。通过全基因合成后构造表达 结果显示表达酶活力较优化前提高25．1％，高密度发酵水平下Glucanasemodification基 U／mL和37．5 因酶活力及比活力分别为34．3 U／mg，较野生型基因分别提高186．8％和 175．2％。同时将所得菌株进行高密度发酵，结果重组183和315菌株表达量分别提高 2．7％和135．5％。 为了研究不同表型对表达量的影响，试验根据酶切位点不同会产生不同的表型，分 别用SaJ I和Bgl 在毕赤酵母中表达，刚果红平板检测显示Mut+型转化子表达量明显高于Mut5，且高密 度水平下，Mut+型转化子表达酶活力为6424U／mL，大约为Muts表达量的53倍。 对GLUm的酶学性质迸行了研究，纯化后该酶比活达到10397 U／mg。SDS．PAGE 该酶相对分子质量处于44．3KD--一29 KD之间，发酵96h，目的蛋白占总蛋白的87．2％， 其最适温度为37。C，最适pH值为5．0。底物特异性分析表明，该酶可水解大麦p．葡聚 糖和地衣淀粉，不降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和羧甲基纤维素钠。体外酶解大麦效果 较佳，且酶解最佳时间为3h，最佳酶浓度为40 U／g。在胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用 60 min后，仍保留了50．5％的酶活力。因此，该葡聚糖酶作为饲用酶制剂具有潜在的应 用价值。 关-mi,：l：产琥珀酸丝状杆菌；1，3．1，4．p．葡聚糖酶；毕赤酵母：表达；酶学性质 万方数据 olofFibrobactertbrobacter 13-1 - ne SUCClilogenes， 1,3 Ext succinog1，4-p-glucanase inPichia pastoris Abstract