红鳍东方鲀4个疫基因的原核表达及群体est-ssrs分析.pdfVIP

Thesis For The Degree Of Master Prokaryotic expression analysis of four immune genes and analysis of group EST-SSRs in Takifugu rubripes Supervisor：Prof. Wang Xiuli Master Candidate ：Sun Saihong College of Fisheries and Life Sciences, Dalian Ocean University Dalian, LiaoNing Province, P.R. China June, 2014 本研究由国家海洋公益性行业科研专项经费项目资助 （201405003-2 ） This Study Was Supported by the National Marine Public Benefit Research Foundation, China (NO. 201405003-2) 摘要 摘要 红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的肉质鲜美，食用价值高，深受人们的欢迎。红鳍东方 鲀的肝脏和生殖腺等内脏可产生河豚毒素，具有很高的活性和特异性，所以在医药开发方面 具有潜在的价值，在临床上其应用前景较为广阔。但与常规养殖鱼类相比，红鳍东方鲀的生 物学特性比较复杂、特殊，所以比较容易受到外界环境因子的影响，故疾病发生率较高。在 病原侵袭机体时，免疫系统起着重要的作用，其主要由免疫细胞，免疫器官和免疫分子（如 白细胞介素）组成。白细胞介素7 （IL-7 ）、IL- 15、IL-15L和干扰素调节因子2 （IRF2 ）是鱼 类免疫系统中较为重要的免疫分子。 (1) 本论文利用 cDNA 末端快速扩增技术（RACE ）从红鳍东方鲀头肾组织中克隆出了 干扰素调节因子2 （IRF2 ），全长cDNA 为1552 bp，其ORF 为936 bp，编码311 个（aa ） 氨基酸，推导的氨基酸分子量为35.5 kDa，等电点为6.56 。其中5 ’非编码区为187 bp，3 ’ 非编码区为429 bp 。经过分析发现，红鳍东方鲀IRF2 可能为亲水蛋白，无信号肽和跨膜结 构，具有DNA 结合域（DBD ）、IRF 结合域2 （IAD2 ）和转录抑制域（TRD ）。与其他物种 同源性分析发现，红鳍东方鲀IRF2 与鳜鱼（S.chuatsi ）的相似度最高，达79%，这些为以 后对此基因功能机制的了解以及深入探讨提供了基础。 (2) 根据NCBI 网站上已发表的红鳍东方鲀IL-7、IL-15、IL-15L基因和克隆的IRF2基因， 设计并合成了用于原核表达的特异性引物，利用PCR技术克隆其成熟肽或编码区的核苷酸序 列，并成功构建了pET32a-IL-7、pET32a-IL-15、pET32a-IL-15L、pET32a-IRF2和pET28a-IL-7 重组质粒，并分别在BL21(DE3)和Rosetta(DE3)细胞中成功诱导表达，得到了相应的融合蛋 白。另外，通过优化表达条件找到了各个基因表达的最佳菌株、IPTG诱导浓度、诱导时间 以及诱导温度的等条件，为进一步表达和大规模生产提供了技术支持和便利。纯化出的目的 蛋白为后续的生物活性测定和免疫疫苗的制备奠定了基础。 (3) 从NCBI 网站的数据库下载红鳍东方鲀的基因组序列和EST序列，然后用SSR-Hunter 软件查找微卫星核心序列，利用35个EST-SSR基因位点的特性对57个红鳍东方鲀个体样本进 行研究。结果表明，每个基因位点有2~7个等位基因数，有效等位基因的平均值为3.3675 。 观测杂合度范围为0.2281~0.7368，平均值为0.4924，而期望杂合度在0.4986~0.8235之间，平 均值为0.6859 。多态信息含量（PIC ）在0.3712~0.7904