蒙古冰草mwla3基因功能研究及mwrrt基因的克隆.pdf

摘 要 蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是禾本科冰草属小麦族多年生草本植 物，不仅具有极高的饲用价值，而且具有很强的抗逆性，富含大量的抗旱、抗寒、耐 盐基因，可以为牧草及近缘种作物（水稻、小麦、玉米等）的抗性改良及新品种选育 提供宝贵的资源。本研究分离出蒙古冰草 MwLEA3 基因并进行了功能验证，并首次克 隆得到了蒙古冰草类反转录转座子。主要研究结果如下： 1. 分离了蒙古冰草 MwLEA3 基因，其全长为 705bp，开放阅读框为 492bp，编码 163 个氨基酸。 2. 构建了蒙古冰草 MwLEA3 基因的亚细胞定位融合蛋白载体 pA7-MwLEA3，并将 此载体及 pA7-GFP 载体质粒转化至洋葱细胞中进行亚细胞定位。试验结果表明， pA7-MwLEA3 融合蛋白集中分布在细胞核中，而对照 pA7-GFP 在整个细胞中均有分布， 证明了 MwLEA3 基因表达的蛋白是核定位蛋白。 3. 成功构建蒙古冰草 MwLEA3 基因植物表达载体 pCAM-MwLEA3，并经农杆菌介导 进行烟草的遗传转化。对经过抗性检测的转基因烟草 T 代植株进行 PCR 检测、 0 PCR-Southern、RT-PCR 鉴定以及干旱胁迫试验。分子检测结果表明，MwLEA3 基因已 整合到烟草基因组中，并在转录水平正常表达；干旱胁迫试验结果显示转基因烟草植 株的抗旱性高于野生型烟草植株。 4. 对 10 个株系转基因烟草 T 代的卡那霉素抗性进行研究表明，10 个株系中， 1 有 7 个株系的 T 代的分离比例为 3:l，符合孟德尔式遗传规律，这表明 MwLEA3 基因 1 是单拷贝插入；另外 3 个株系的 T 代不符合孟德尔式 3:1 的遗传规律，说明这些植 1 株中的 MwLEA3 基因可能是多个拷贝插入的。 5. 构建了 35S 启动子调控的具有 MwLEA3 基因反向重复结构的 ihpRNA 表达载体 pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX)，并通过冻融法转化将MwLEA3 基因的 ihpRNA 表达框 架成功导入根癌农杆菌 LBA4404 中。利用带有目的表达载体的农杆菌菌液侵染蒙古冰 草愈伤组织，现正在筛选分化培养基上培养，后续试验正在进行中。 6. 首次克隆得到了蒙古冰草类反转录转座子（MwRRT）基因，该基因片段长度为 1005bp，在1～225bp为非编码区，长度为225bp，其氨基酸序列在226～1005bp，共 780bp，编码260个氨基酸。核苷酸及氨基酸同源性对比分析发现，所克隆基因与小麦 （Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、大麦（Hordeum vulgare ）、高粱（Sorghum bicolor）的LTR类反转录转座子的核苷酸同源性约70%，氨基酸同源性约50%，GenBank 登陆号NO.GQ855806.1。 关键词：蒙古冰草；MwLEA3 基因；亚细胞定位；功能验证；MwRRT 基因；克隆 Function Analysis of MwLEA3 and Cloning of MwRRT gene of Mongolia Wheatgrass Abstract Mongolia Wheatgrass (Agropyron mongolicum Keng), a perennial grass, belongs to Agropyron genus in Gramineae, not only has high feeding value, but also rich in resistant genes,such as drought-tolerant gene, cold- tolerant gene, salt-tolerant gene and so on. It could provide valuable resource for the improve