诱导表达的萝卜真菌蛋白（rs-afp2）基因转化辣椒的研究.pdfVIP

诱导表达的萝f、抗真菌蛋白(Rs-AFP2) 基因转化辣椒的研究 摘要 辣椒是一种重要的蔬菜作物和调料品，营养丰富、经济价值高，深受人们的喜爱。 但由于各种病害的危害，辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直 是十分重要的研究课题。利用常规育种手段从现有资源中选育出高抗、优质、高产品 种难度大，耗时长。植物基因工程技术的发展与完善，为作物的遗传改良提供了新的 策略和强有力的工具，转基因技术已在200多种植物中获得成功。辣椒基因工程经过 近lO年的研究，已经取得了一些成就，但进展缓慢。离体再生困难和遗传转化率太 低是限制其发展的两大因素。本研究以产量较高的常规品种一保加利亚尖椒的子叶为 主要试材，分别就各种影响辣椒离体再生的因素进行了研究，建立了辣椒植株再生体 系，并建立农杆菌转化辣椒的方法体系。在此基础上，将从胡萝卜克隆的萝卜抗真菌 分子检测，证实获得了外源基因已经整合到植物基因组的转基因辣椒植株。 所获得的主要结果如下： 1．pPBR-2转化农杆菌GV3103 用CaCl：法将质粒pPBR一2转导到农杆菌GV3103中，经抗生素平板筛选阳性单克 隆，进行PCR检测确认植物表达载体已成功转导到农杆菌中，可作为农杆菌工程菌进 行辣椒的遗传转化。 2建立了辣椒再生体系 本文研究了影响辣椒(保加利亚尖椒)子叶外植体不定芽诱导分化的多种因素， 优化了各种条件，建立了保加利亚尖椒的高效再生体系。结果表明，在适宜的茵龄条 4．0 件下。可获得10096的不定芽分化率。晟佳不定芽诱导分化培养基为：MB+6-BA 2 mg／L+I从0．5mg／L+AgN魄2mg／L+PDmL／L；最佳不定芽伸长培养基为：畸+ 6一BA2．0IIlg几十I从0．2 mg／L+G／hO．2mg／L+AgNO。2rag／L+PD2raL／L；最佳生根 培养基为：1／2MB+IAA 0．8mg／L。并发现，少量AgN03能在一定程度上地促进芽的 诱导分化和防止外植体褐化；并且辣椒幼苗提取汁液对外植体不定芽的诱导分化起重 要的促进作用。 3．优化了辣椒遗传转化体系 本文研究了农杆菌介导转化辣椒子叶的各种影响因素，优化了遗传转化体系。预 培养2d，以农杆菌液侵染7～8min，共培养2d后进行芽选择分化培养(Kan25mg／L，Cef 300mg／L)。在伸长培养基上伸长到一定K度后，再经选择性生根培养(Kan20mg／L)， 最终获得抗性苗。 4．获得了萝h抗真菌蛋白(Rs．AFP2)基因转化的辣椒植株 采用PCR方法对辣椒转化植株进行检测。提取抗性植株的总DNA为模板，以质 粒DNA为阳性对照，以未转基因植株为阴性对照，利用外源基因的特异引物进行PCR 扩增，电泳检测，证实Rs—AFP2基因已经整合到保加利亚尖椒基因组中。其表达量， 以及真菌诱导表达对辣椒抗病性的影响有待于进一步的研究。 关键词： 辣椒， 萝卜抗真菌蛋白基因， 遗传转化， 诱导型表达 II TransformationofInducible Expression into ProteinGene Raphanussatives—Antifungal annuam Pepper(CapsicumL．) Abstract Asakindof andthe in importantvegetables