豇豆褪绿斑驳病(cowpea chlorotic mottle virus)突变体混合侵染中rna重组的研究.pdfVIP

中文摘要 l lRNA病毒是侵染植物的最大病毒类群。此类病毒的一个重要特点 就是在寄主体内存在基因序列的多态性。已知在寄主植物中的RNA病 毒种群并非以基因序列完全～致的克隆形式存在，而是以具有某些共 同的序列段的、同时又包含明显相互不同的RNA序列段的各种病毒个 体所组成。RNA病毒的这种特点主要是由于在病毒的复制中，依赖于 RNA的RNA聚合酶的阅读错误及发生RNA重组所产生的，对于多分体 RNA病毒，在装配RNA基因组时的筛选作用，也可以产生RNA病毒的 多态性。已有研究采用几种RNA病毒为模板，确定了RNA聚合酶在病 毒RNA基因组复制中的错误率，一般来说RNA聚合酶的错误率约在 10一左右，即平均大小在10Kb左右的RNA病毒基因组，大约每复制一 次产生一个碱基的错误。 RNA重组可以将外源RNA基因片段整合到病毒基因组中，显著影 响RNA病毒种群中的基因变异，在RNA病毒的进化中起着重要的作 用，病毒通过RNA重组可以将大的外源基因片段整合到病毒基因组 中，或者通过重组修复基因组内有害的突变序列。研究发现：在RNA 病毒的自然混合侵染中存在RNA重组，病毒RNA可以与转基因植物所 表达的病毒基因RNA间、还可以与寄主RNA间发生重组。需要指出的 是：因为转基因作物所表达的转病毒RNA片段可能与侵染植物的病毒 RNA发生重组，这样就有可能产生独特的“杂交病毒”，因此对抗病毒 转基因植物可能带来的经济学和环境学风险性，需要特别关注y＼／ 本研究采用豇豆褪绿斑驳病毒作为研究对象。豇豆褪绿斑驳病毒 kb)、RNA2 是～个三分体正链RNA球形病毒。其基因组由RNAI(3．2 (2．9kb)和RNA3(2．1 kb)3条单链RNA所组成，采用RNAl、RNA2和 RNA3接种植物后会产生一条编码外壳蛋白的亚基因组RNA4。RNAl和 kD蛋 kD和94 RNA2都是单顺反子，分别编码病毒复制所需的109 kD蛋白(3a蛋 白，RNA3是双顺反子，编码负责细胞间运动的32 kD外壳蛋白。病毒的复制不需要3a蛋白和外壳蛋白，但 白)及21 在病毒的系统侵染中需要这两种蛋白的参与，因此，豇豆褪绿斑驳病 毒RNA3是研究RNA病毒重组的理想材料。 本研究首先采用PCR点突变的方法，将连接于质粒pBluescriPt RNA3的CDNA克隆进行点突变，并获得TP7、 (KS+／一)上的CCMv ， TP7在外壳蛋白基因的5’端前面形 TP8和AGl三种RNA3的突变体。f f 3a基因的5’端前面形成了 成一个SalI酶切点；TP8在CCM。V—RNA3 一个BamEI酶切点：AGl在外壳蛋白基因的3’端后面形成为一个 Not I酶切点。以CCMV cDNA克隆为模板进行转录，TP7、TP8、AG和野生型RNA3转录产物分 别与CCMVRNAl，RNA2的cDNA转录产物混合后接种豇豆幼苗。并以 野生型RNA3(C3)作对照。由TP7接种的植物，病毒侵染的症状出现 最快，在接种后的第6天肉眼可观察到心叶明显的花叶症状；TP8和 C3(野生型病毒)接种的植株在接种后的第9天肉眼可观察到心叶 明显的症状；而由AGl接种的植株症状出现最慢，在接种后第L0天 才可肉眼观察到心叶沿叶脉周围的点状花叶。TP7接种的植物的症状 发展最快，第20天全株出现系统的花叶症状。 苗建立了CCMV混合侵染体系，接种后的第20、25天，分别从 析，结果表明：在TP7+TP8、TP7+AGl混合接种中，TP7在竞争中占优 势，在TP8+AGI混合接种的植株中TP8和AGl表现出相近的竞争力和 群体数量。)／／^／