康氏木霉纤维素cbhⅰ基因克隆及在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

河南农业人学硕士论文 内容摘要 纤维素是自然界II，分布最广、含黾最多的‘种仃机化合物，占植物干重的1／3～1／2，足世界 总罩最火的可再生资源，合理地开发与利用纤维素资源对于缓解能源危机、粮食短缺、王1：境污 染等问题具有十分重要的意义。利用微生物及其产生的纤维素酶来分解纤维素足种有效且无 污染的方法。纤维素酶足降解纤维素的高活性生物催化剂，广泛用于例料、王li保、食品、酿酒、 纺织、造纸等领域。但天然的微生物生产纤维素酶存在酶产罩低、活性低、受到葡萄糖等产物 的反馈抑制等许多问题，这些问题极人地影响了纤维素酶的T业化生产。应用基冈T程技术来 获得高活力、高产晕的纤维素酶资源越来越受到人们的重视。 纤维素外切酶是纤维素水解酶系巾唯，‘可以作用于结晶纤维素的酶组分，对纤维素的降解 111扩 有着重要的作用。本实验从纤维素酶高产菌康氏木霉(Trichodermakoningii)的染色体DNA 增得到外切葡聚糖酶CBH I并通过高压电击于段转 I基冈，构建重组表达质粒pGAPZaA．CBH I基因在毕赤酵母小的表达。 入到毕赤酵母(Pichiapastoris)X．33一p实现了CBH 主要内容包括以下： 采用PCR技术扩增得到CBH I基冈，与克隆载体PMDI9-T连接后转入人肠杆菌DH5a， 测序及序列比对结果显示该DNA序列全长l626 viride bp，与Genbank止公布的Trichoderma kDa，蛋白质等电点pI=4．28。 将CBH I基冈与表达载体pGAPZttA连接后，通过过渡宿主火肠杆菌再转化到毕赤酵母 x．33 I}I，将经过鉴定的重组酵母茵株接种于YPD液体培养基，定时取样进行纤维素酶活性测 定与SDS—PAGE蛋白电泳检测，并对其产酶性质进行分析。结果显示：重组酵母菌发酵培养液 U／mL， 羧甲基纤维素酶活力最高达到1．1798U／mL，微晶纤维素酶活力最高达到0．1276 SDS—PAGE蛋白电泳显示表达蛋白的分子量约为53kDa。结果表明康氏木霉纤维素酶CBHI基 因在毕赤酵母中成功表达。该重组酶最适反应温度为45～50。C，最适反应pH为4．5～5．0。 关键词：CBH I基冈；毕赤酵母；克隆和表达 河南农业大学硕士论文 Summery Celluloseisakindof resourcethataccounts recycled 1／3-1／2ofthe andisthe plantdryweight most abundantcarbonsourceonearth．If organic thesenaturalresourcescanbe used，it effectively willhave forhumankindto practical solvethe significance crisis，food