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扫描电子显微镜样品制备 小组成员：裘英华，张国荣，薛晓波， 储钢，金志华 2010-1-6 扫描电镜相比透射电镜的一大优点：样品制备简单。 但不意味着样品制备可以随意进行。忽视样品制备，往往影响检测结果。 1.扫描电子显微镜原理 二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。 制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。 2. 对样品要求 不会被电子束分解。 在电子束扫描下热稳定性要好。 能提供导电和导热通道。 大小与厚度要适于样品台的安装。 观察面应该清洁，无污染物。 进行微区成分分析的表面应平整。 3. 介绍几种样品制备方法 块状样品 粉末样品 生物样品 3.1 块状样品制备 块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。 对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。 试样与样品座的粘结情况 对于金属、岩矿或无机物，切割成要求的尺寸，粘在样品台上。如果样品数量多，注意样品尺寸最好一致。 微区成分分析样品表面应该平坦或经研磨抛光，可以保证检测时几何条件不变。对于样品的断口面，要选择起伏不大的部位，最好是分析点附近有小的平坦区。样品表面和底面应该平行。 3.2 粉末样品制备 1　直接撒粉法 将粉末直接撒在清洁光亮的样品台上,滴一滴0.5%火棉胶醋酸戊脂溶液于试样边沿,火棉胶液立即浸润粉末,再把试样台水平轻轻晃动几下,使试样分布平整、均匀,并用电热风吹干,粉末固定在样品台上即可放入电镜内进行观察。 优点：制样方法简单,但均匀性差,适应于一般要求的粗颗粒样品的观察。 2　导电胶粘结法 对于150-500um粉末可采用一薄层导电胶将粉末粘在已抛光的铜样品台上,其基本做法是先在样品台上均匀涂上一层导电胶(Ag胶、石墨孔胶等),然后将粉末撒在上面,把试样台面朝下使不与胶层接触的粉粒脱落,这样,在表面留下被导电胶粘结的均匀一层。 制样的关键：导电胶涂敷要均匀,平整,尽可能薄一些,否则会造成视场起伏或颗粒下陷于胶体内,造成立体失真。 3　溶液均匀法 细粉末的分散好坏是决定测量结果准确性的重要因素。当粉末粒子为0.5-4um或小于0.5um时,其表面活性很大,常常是以互相粘附的二次粒子状态存在。 将粉末颗粒放在酒精或乙醚等清洁且又不与粉末发生反应的溶剂中,加入少许分散剂(偏磷酸钠等),并均匀摇动或用超声波振荡器和手动搅拌器结合等分散方式,使其分散均匀。用吸管将含粉粒的溶液滴到清洁光亮的样品台上,再用一根小小的木棒粘上少许酒精在样品台表面上留下一层较均匀的粉粒,滴一滴0.5%火棉胶醋酸戊脂溶液于试样边沿,并用电热风吹干即可放入电镜内进行观察,这种方法特别适合于观察单颗粒的细微粒子。 3.3 生物样品制备 超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞的三维结构，而且在观察切片后所拍摄的显微照片时，容易造成错误的印象，用扫描电子显微镜(SEM)能直接观察标本表面的三维空间结构，真实地反映各种细胞表面和断裂面的形态特征。 扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水等。 扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨碍着观察，以致造成对图像的错误解释，所以，在固定前都必须特别做好表面的清洁工作。 葡萄球菌的细胞表面 具体制备步骤 1 、取材 ??? 一般原则与超薄切片相似，但用于扫描电镜观察的样品块略大，通常为 5mm × 8mm 左右。　 2 、清洗、固定??? 铺片培养的细胞取出浸入磷酸盐缓冲液 （PBS） 中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加 4 ℃ 预冷的 3% 戊二醛，在 4 ℃ 固定 2h 或过夜，吸出固定剂，用 PBS 浸洗 2 次，每次10min ，再用 4 ℃ 预冷的 1% 锇酸。在 4 ℃ 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。 3、脱水 ??? 丙酮 / 醋酸异戊酯(1:1)脱水 10min ，接下来醋酸异戊酯脱水 30min ，或用系列梯度酒精（ 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% ）脱水，每种浓度酒精通过 2 次，每次 15min