喜树愈伤组织和片中喜树碱含量变化研究.pdf

摘 要 acuminata 喜树(CamptothecaDecne．)是我国南方特有树种，它所含的喜树碱 种拓扑异构酶I(TopoisomeraseI)抑制剂，被誉为21世纪人类首选的3 I，Topo 大抗癌药物之一。本试验探讨了诱导喜树愈伤组织的最佳培养基，以及外植体类型和 取材季节对愈伤组织诱导的影响，并采用高效液相色谱法(HPLC)对CPT的提取方 法、不同处理条件下愈伤组织中CPT的含量变化，以及叶片中CPT含量的季节变化 进行研究，结果如下： 1．本试验的最佳色谱条件为：以乙腈／水(V／V=30／70)为流动相，流速1．0ml／min， u 柱温25。C，进样量20l，检测波长254Bin。在该色谱条件下喜树碱的保留时间适中， 约为6．3min，峰形良好。 2．提取CPT的最佳方法为95％乙醇索氏回流提取，样品不经任何处理，测得 提取液中CPT含量极显著的高于95％乙醇超声提取和0．3％NaOH溶液碱法提取。 3．以嫩叶和带芽茎段为外植体，在MS+NAAl．0 mg／L+IBAl．0 mg／L+KT0．1mg／L 培养基上，愈伤组织的诱导率高，30d时统计可达90．0％以上，愈伤组织质地好、生 长迅速；以嫩叶为外植体诱导的愈伤组织，在MS+NAA0．05 rag／L+6．BA0．25 mg／L培养基上不能分化出不定芽，而以茎段为外植体诱导的愈伤组织， mg／L+KT0．5 在MS+NAA0．05 d mg／L+6一BA0．25mg／L+KT0．5 mg／L培养基上诱导分化不定芽，30 后统计芽分化系数可达4．2。 4．SH基本培养基较1／2MS、MS、B5和White4种基本培养基更有利于愈伤组 织中喜树碱的积累。在SH基本培养基上，以嫩叶为外植体诱导的愈伤组织的CPT 含量最高，可达O．0382‰，显著高于以茎段和叶柄为外植体诱导的愈伤组织。 5．最佳取材季节为7月，在sH_咐AAl．0 mg／L+KT0．1 mg／L+IBAl．0 mg／L培养 基上，愈伤组织中CPT含量可高达0．0412‰，愈伤组织诱导率也较高，为82．2％， 外植体污染率为18．5％。 6．NAA和IBA对CPT的积累有显著影响，最佳处理浓度均为3．0 mg／L，在此 浓度下处理10 伤组织的存活率均能达到90％以上。 本研究为四川省科技厅攻关项目“喜树的组织培养和喜树碱的提取研究”的部分内容 7．经秋水仙碱处理后愈伤组织的存活率和CPT含量均会迅速下降；经20 mg／L 的8．羟基喹啉处理10d，愈伤组织中CPT含量能高出CK51．4％，愈伤组织存活率 也能达到90％以上。 8．叶片中CPT含量分别在6月和9月出现峰值，6月含量为全年最高，嫩叶可 达1．941‰，成熟叶可达1．325‰。所有月份中嫩叶的CPT含量均极显著的高于同 期的成熟叶。 9．从最佳采叶时间来看，4月份以5日龄内的叶片的CPT含量最高，可达1．114 ‰以上；7月份以3日龄内的叶片的CPT含量最高，可达1．960go以上；而10月份 则以7日龄内的叶片的CPT含量最高，可达0．950‰以上。相同叶龄叶片的CPT含 量，7月极显著的高于4月，4月(除7日龄叶外)极显著的高于10月。 以上结果表明，以7月的嫩叶为外植体，选择