奶牛乳房炎大肠菌间接elisa方法的建立和初步应用.pdfVIP

摘要 本研究通过weStemblot方法对大肠杆菌乳房炎分离株进行菌体蛋白分析，找出了主要免疫 原性蛋白为约33kDa的膜蛋白，应用超声破碎、超速离心、电洗脱等方法对其进行纯化，以其 作为包被抗原，建立了间接ELIsA方法。 以膜蛋白作为抗原包被酶标板，通过对ELISA各反应条件的优化，确定了最佳反应条件为： 抗原的最佳包被缓冲液为0．01M pH7．2的PBS；抗原最佳包被浓度为O．25p∥mL；最佳封闭液为 5％脱脂奶粉，封闭条件为37℃lh：最佳血清稀释液为5％脱脂奶粉，血清稀释倍数为loo倍； HRP．兔抗牛IgG的最适工作浓度为1／20000。采用已确立的ELISA反应条件，对210份阴性血 清的检测结果进行统计学分析，确定了间接ELISA方法阳性血清判定标准，即OD4。值大于等 于0．32为阳性，小于O．32为阴性。应用建立的间接ELISA方法对72份乳房炎疫苗免疫牛血清 和224份未免疫牛血清的检测结果表明，ELISA方法的特异性为93％，敏感性为72．2％。 采用建立的间接ELISA方法对奶牛乳房炎多联灭活疫苗免疫牛血清中大肠杆菌特异性抗体 水平进行了检测，揭示了疫苗免疫牛大肠杆菌抗体水平的动态变化，为该疫苗I