b7-h4靶向hrna干扰小鼠间充质干细胞c3h10t12的构建及其生物学功能的初步研究.pdf

B7-H4 靶向shRNA 干扰小鼠间充质干细胞系C3H10 T1/2 的构建及其生物学功能的初步研究 中文摘要 B7-H4 靶向shRNA 干扰小鼠间充质干细胞系C3H10 T1/2 的构建及其生物学功能的初步研究 中文摘要 目的：构建小鼠B7-H4 靶向shRNA 稳定转染的鼠间充质干细胞株C3H10T1/2( 以 下简称C3H10)，通过体内外实验探讨B7-H4 分子在C3H10 细胞移植治疗EAE 中的 免疫抑制作用。 方法：应用流式细胞仪、Western blot 等方法检测C3H10 细胞中B7-H4 分子的表 达情况；将装载有小鼠B7-H4 分子小片段shRNA 的慢病毒颗粒转染C3-H10 细胞系 (C3H10-shRNA-B7-H4) ；利用载体的嘌呤霉素抗性筛选转染的C3-H10 细胞，通过荧 光显微镜及流式细胞仪（FCM ）检测shRNA 的转染效率。通过流式细胞仪、RT-PCR 及Western blot 等方法检测不同序列的特异性shRNA 干扰C3-H10 细胞后B7-H4 分子 的mRNA 及蛋白表达水平，得到干扰效率较好的一株C3-H10-shRNA-B7-H4 细胞， 将其与小鼠脾脏淋巴细胞共同培养，用FCM 检测其对淋巴细胞增殖、细胞周期及细 胞凋亡的作用。建立 EAE 小鼠模型，分假手术组、造模组、C3H10 细胞移植组、 C3H10-shRNA-NC 细胞移植组、C3H10-shRNA-B7-H4 细胞移植组，其中C3H10 细胞 移植组、C3H10-shRNA-NC 细胞 （转染了未含靶向分子的对照shRNA 的C3H10)移 植组、C3H10-shRNA-B7-H4 细胞 （转染了含靶向分子B7H4 shRNA 的C3H10)移植 组在免疫后第8 天分别将C3H10 细胞、C3H10-shRNA-NC 细胞、C3H10-shRNA-B7-H4 细胞注入建立的EAE 模型小鼠体内，观察各组小鼠的发病神经功能评分及体重变化 情况，与对照组相比较。 结果：FCM 及Western blot 检测显示C3-H10 细胞高表达B7-H4 分子；荧光显微 镜及FCM 检测显示shRNA 转染C3-H10 细胞的效率高达80% 以上；通过嘌呤霉素筛 选后得到的C3-H10 细胞转染效率在95% 以上，且能稳定传代；有4 对特异性shRNA 对B7-H4 mRNA 及蛋白均有不同程度的下调，其中以shRNA- 1 对B7-H4 的下调作用 最强，作为最佳特异性 shRNA；C3-H10 能明显抑制经PHA 激发的小鼠脾脏细胞的 活化和增殖，使细胞周期阻滞于G0/G1 期，该免疫抑制效应在PHA 激发的脾细胞与 I 中文摘要 B7-H4 靶向shRNA 干扰小鼠间充质干细胞系C3H10 T1/2 的构建及其生物学功能的初步研究 C3-H10-shRNA-B7-H4 细胞共培养组被部分逆转；C3-H10 细胞可保护与其共培养的 PHA 激发的小鼠脾脏淋巴细胞免受AICD ，此效应在其与C3-H10-shRNA-B7-H4 细胞 共培养组被部分逆转。 体内实验显示假手术组无发病，C3H10 细胞植入组及C3H10-shRNA-NC 细胞植 入组较造模组发病时间延迟且发病症状较轻，神经功能评分维持在较低水平，体重呈 持续增长趋势；而 C3H10-shRNA-B7-H4 植入组发病时间介于 C3H10 细胞移植组及 造模组之间，发病高峰与造模组同时期，神经功能缺损评分介于 C3H10 细胞移植组 及造模组之间，但发病小鼠转归较造模组好。 结论：1、成功构建了小鼠B7-H4 靶向 shRNA 稳定转染的小鼠间充质干细胞株 C3H10T1/2，B7-H4 分子表达明显下调。 2 、体外实验显示B7-H4 分子参与了C3H10 细胞对小鼠脾脏细胞活化、增 殖的免疫抑制作用，使多数细胞细胞周期阻滞于G0/G1 期，表达B7-H4 的C3H10 细 胞能够保护经PHA 刺激的小鼠淋巴细胞免受AICD 。 3、体内实验显示B7-H4 分子在C3H10 细胞移植治疗小鼠EAE 模型的病 理过程中发挥了一定作用。 关键词：B7-H4 ； shR