第讲克隆基因的表达与产物纯化外源基因在真核细胞中的表达精要.pptVIP

酵母菌載體 (Yeast vector) 依其能否獨立複製 (是否具有複製相關序列)可分為：一、Integrating vector：無法自行獨立複製。載體不具複製序列，必須嵌入酵母菌的染色體內才能隨著細胞分裂時複製。純粹是基因選殖時，製備 gene library時使用。二、Replicating vector：具有複製相關的序列，依其複製序列種類分為：(1)??2 μ plasmid：從酵母菌天然的質體上截取一段包含複製序列的 2μ DNA。其優點是非常穩定，可確保細胞分裂時，質體的性狀可移交到子代中不會遺失。而且是 high-copy number的質體。(2) ARS plasmid：從酵母菌的染色體中截取一段ARS element，ARS是表示Autonomously replicating sequence。ARS-containing plasmid的穩定性較差，質體常被分解而無法代代相傳 。但是若加入一段centromere (CEN) sequence (稱CEN plasmid)，就可使質體穩定性提高。但是其copy number較低，一般僅為 single copy。因此要選擇 2 μplasmid或 CEN plasmid依實驗者所需的 copy number而定，Copy number 的多寡常會影響訊息表現的程度，因此：若是希望看到插入 DNA於轉形酵母菌中大量表現，就會使用 2 μ plasmid；若是希望插入DNA的表現處於正常生理的常態，就會用CEN plasmid。另外，還有一種CEN plasmid (只要載體上有CEN 序列，即是CEN plasmid)就是YAC (yeast artificial chromosome)，這種線形載體除了上述ARS, CEN序列外，兩端再加上telomere序列，形成彷彿就是染色體般的外觀，故名之。其特性是容量 (capacity) 超大，可承載 0.2~2.0 Mb DNA的長度。一般 gene cloning 較不使用，較被用於genomic library的建構或分析較大基因組的特性時使用 4. Ti质粒转化的对象 5. Ti质粒作为载体的可能性 （1）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。 （3）强启动子： T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动 子，能启动外源基因的表达。 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。 6. 天然Ti质粒作载体的缺点 （1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。 （4）在大肠杆菌中不能复制。 7. Ti质粒的改造 （1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。 （4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。 （2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。 （3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不 再成为肿瘤，能正常分化。 （5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。 （6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加 polyA的信号序列。 8. Ti载体的类型 （1）共整合载体（cointegrate vectors） 最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850 需要同源重组才能插入外源基因。 ① pGV3850的特点： 是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。 ② 选择标记 1）脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。 2）最终受体植物的选择标记 卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！） 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。 ③ 外源基因插入pGV3850 的过程 pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。 只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。 （2）双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。 ① 双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb） Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合） ② 双元载体的转化 1）基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。 Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。 2）帮助质粒（ helper plasmid） 受体