中国对虾氨氮代酶基因的cdna克隆及其在氨氮解毒代谢过程中的作用.pdfVIP

Master Dissertation cDNA cloning and expression analysis of the enzyme genes related to ammonia metabolism in Fenneropenaeus chinensis and study on effect of these enzymes in the detoxification of ammonia following ambient ammonia stresses Master Candidate: Li Shaofei Supervisor: Prof. Li Jian Prof. Li Xia College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University Dalina, Liaoning P.R.China May, 2014 2 摘要 摘要 中国对虾 （Fenneropenaeus chinensis ）是黄渤海海域十分重要的养殖虾类，具有生长 速度快、对低温耐性强、品质好等特点。 中国对虾“黄海 3 号”是本实验室经过长期选育 而培育出的中国对虾新品种，具有抗逆性强的新特性，能够在较高的氨氮及 pH 环境下生 存。 氨氮是衡量水质质量好坏的重要标准，已有研究表明养殖水环境中氨氮含量过高会对 对虾的生理机能及对细菌和病毒的的抵抗力有显著的影响，甚至导致对虾非病原感染性死 亡。天门冬氨酸氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是生物体氨基酸分解代谢及 氨氮转化和排泄过程中的关键酶，本实验对以上酶基因 （天门冬氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢 酶）进行了 cDNA 全长克隆并对其在氨氮代谢中的作用进行了研究，以期为中国对虾氨 氮代谢途径的研究提供依据以及对“黄海 3 号”抗逆性机制的研究提供实验基础。 研究内容包括以下三个部分： 第一部分：中国对虾天门冬氨酸转氨酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对 4mg/L 和 16mg/L 氨氮胁迫下的中国对虾肝胰腺和鳃组织中的天门冬氨酸转氨酶活力进行了测 定。结果显示，两胁迫组实验过程中大部分时间酶活力均被抑制。 利用RACE 技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)天门冬氨酸转氨酶GOT 基因(FcGOT) 。FcGOT 基因 cDNA 全长为 1 910 bp, 其中，开放阅读框 1 284 bp,编码 427 个氨基酸。同源性分析表明，中国对虾天门冬氨酸转氨酶 GOT 氨基酸序列与其他节肢动 物高度保守，与克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和桔粉蚧壳虫(Planococcus citri) 的同源性 分别为 78%和 73% 。系统进化分析表明，FcGOT 基因氨基酸序列与克氏原螯虾 GOT 聚 为一支。 组织表达分析发现 FcGOT 基因在肝胰腺、鳃、血细胞、肌肉、心脏、淋巴中均有表 达, 其中肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，荧光定量 PCR 分析结果表明，FcGOT 基因 在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比具有显著差异(P0.05) ，表明 FcGOT 基因在氨 氮代谢方面具有重要的作用，参与了中国对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。 第二部分：中国对虾谷氨酸脱氢酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对不同浓度氨 氮胁迫后肌肉组织中 GDH 活性变化进行了测定，结果表明，氨氮能够刺激 GDH 酶活力 增强。实验过程中，两胁迫组的 GDH 活力均上调，16mg/L 组上调的幅度比 4mg/L 组大。 采用RACE 技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶GDH 基因 (FcGDH) 。FcGDH 基因全长 1779bp,包括一个 1659bp 的开放阅读框(ORF) ，编码 55