双位点保守基因异性pcr-ce-rflp快速鉴定病原菌.pdf

双位点保守基因特异性PCR—CE—RFLP快速鉴定病原菌 硕士研究生：高鹏 指导教师：张卓然 教授 专业名称：病原生物学 摘 要 原核生物的rRNA基因位点(姗)具有高度的保守性，同时不同菌属细菌之 间又存在相对稳定的变异性，因此广泛被用于细菌的种系发生学与分类学的鉴定 rRNA和16S～23S 上。其中16s rRNA间区是最常用的两个基因。针对16srRNA基 因，许多学者选择不同的变异区利用不同的引物对该基因片段进行PCR扩增，然 后通过诸如单链构象多态性等方法试图达到提高细菌鉴定效率的目的，虽然对大 多数细菌来说分辨效果较好，但是对大肠埃希菌和志贺菌属这样常见的细菌却无 法区分。还有人利用16S一23S rRNA间区基因进行PcR反应，然后将产物进行琼脂 糖电泳，虽然该基因的扩增产物在各个种属细菌之间无论是片段长度还是片段数 目上都呈现多态性，可将大部分细菌区分开来，但是由于所用的PcR反应时间较 长，并且不能准确确定片段长度即没有可以利用的数量化指标，所以应用上受到 一定限制。同样对常见的葡萄球菌属内的细菌，鉴定结果极不稳定，也不利于该 法的推广。为了有效利用上述两个基因，并且克服方法学上的不足．我们筛选了 上述两个基因的合适引物，分别用FAM和JOE两种荧光素标记，并且将模板制各 过程加以简化，即直接在99℃条件下裂解10分钟，避免了长时间的DM提取的复 杂操作，适当调整了PCR反应条件，不仅让两种引物能同时在同一条件下反应， 而且使得16S一23srRNA间区基因的次级产物量尽可能减少。经过对三株标准 (ATcC)菌株和两株阴性对照真菌的DNA PCR扩增比较后．发现效果很好。所得 产物先用普通琼脂糖凝胶电泳，再分别用限制性内切酶胁eⅢ进行不完全酶切， 力图尽可能得到比较多的酶切产物片段。酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳 (PCR—CE—RFLP)，测定酶切片段长度差异，目的是要初步建立一个I}缶床常见菌的 标准PcR—CE—RFLP数据库，以便用于细菌鉴定。本实验共检测革兰阴性、阳性病 原菌183株，分属5个属19个种。经过分析后发现，针对16Sr刚A基因的RFLP rRN^ 谱数据仅仅能将细菌鉴定到“科”的程度，无法再进行更细的分类；而16S一23s 间区基因的PcR产物虽然大部分细菌之间无论在片段长度还是在片段数量上都有 较大区别，但个别种属内仍然有相似的谱型出现，经过PcR—cE—RFLP分析后，则 可将所有细菌鉴定到“种”的程度，也包括前文提到的那些无法区分的菌株。虽 然本文的结果显示单纯应用16S一23srRNA间区基因的RFLP结果就能区分所有细 rIlNA基因的结果一并考 菌，但是由于临床面对的细菌种类繁多，我们建议将16S 虑，以便在鉴定时能提供一些辅助信息。本文证实：利用16SrRNA基因和16S一23S rRNA间区基因PCR—CE—RFLP进行细菌鉴定简便快捷，能将传统方法需要十几个小 时甚至几十小时的鉴定工作用四个小时左右完成，是一种极有临床应用价值的快 速论断方法。 16s 16s一23s 关键词： rRM基因 rRNA间区基因病原菌 聚合酶链反应(PCR)限制性酶切片段长度多态性(RFLP) MeansofTwo Bacteria Identi6catiOⅡof by Rapid Pathogenic C0nservableGeneLOcuses PCR．．CE—R母LP