伤寒沙门菌质粒dc成熟及其自噬过程和免疫功能的影响.pdfVIP

伤寒沙门菌质粒对DC 成熟及其自噬过程和免疫功能的影响 中文摘要 中文摘要 伤寒（typhiod fever ）又称为肠热病（enteric fever ），是一种古老的由伤寒沙门 菌（Salmonella typhi ，S.typhi ）引起的急性肠道传染病。20 世纪80 年代末至90 年 代初，我国十三省市曾发生大规模多重耐药伤寒沙门菌的暴发流行。对 591 例伤 寒沙门菌临床分离株进行药敏、质粒电泳、接合转移、转化及消除试验后发现， 6 流行期间分离的多重耐药菌株均含一分子量98.6 ×10 道尔顿（98.6 Md，约159 Kb） 的耐药质粒，可编码对多种药物的抗性，属不相容性C 群（IncC ），称之为pRST98 。 该质粒具有多效性，除编码抗药性外还能增强宿主菌的毒力，是一种既能介导细 菌耐药性又能增强细菌毒力的具有双重功能的 “嵌合型”质粒。伤寒沙门菌是兼 性胞内致病菌，具有靶向感染专职抗原提呈细胞 （antigen presenting cell，APC ） 的特点，侵入机体后可定居在树突状细胞（dendritic cell，DC ）内生长繁殖。DC 是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，在抗沙门菌感染免疫反应中起着关键作用， 任何对DC 功能的干扰都可能影响感染结局。 本研究通过建立沙门菌感染的细胞模型和实验动物模型，研究伤寒沙门菌质 粒pRST98 对DC 成熟及其自噬过程和免疫功能的影响，揭示其增强宿主菌毒力的发 生机理，为下一步继续深入研究质粒的毒力机制提供实验和理论依据。 第一部分 伤寒沙门菌质粒对DC 成熟和自噬过程影响的体外实验 以携带 pRST98 的野生株 S.typhi-WT 、消除 pRST98 的伤寒沙门菌突变株 S.typhi-Δ-pRST98 以及pRST98 经接合转移重新导入 S.typhi-Δ-pRST98 所获得的回补株 S.typhi-c-pRST98 为研究对象，将细菌与小鼠骨髓来源的 DC （bone marrow-derived DC ，BMDC ）共培养建立体外感染模型。分别在感染的不同时间段（2 h、4 h、12 h 和24 h ）收获细胞，采用以下方法进行实验检测：① 流式细胞术（flow cytometry， FCM ）检测DC 表面共刺激分子CD40、CD和CD86 的表达以及DC 的吞噬能力； ② 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）检测细胞Th1 型细胞因子γ-干扰素（Interferon-γ ，IFN-γ ）和白细胞介素-12 （interleukin-12，IL-12） 及Th2 型细胞因子IL-10 的表达；③ Western Blot （WB ）检测细胞自噬标志蛋白 I 中文摘要 伤寒沙门菌质粒对DC 成熟及其自噬过程和免疫功能的影响 ——微管相关蛋白1 轻链3-II （Microtubule-associated protein 1 light chain 3-II ， MAP1-LC3-II ，即LC3-II ）和Beclin- 1 的表达；④ 透射电镜（transmission electron microscope ，TEM ）观察细胞内自噬小体。 实验结果表明，① S.typhi-WT 感染组DC 表面CD40、CD和CD86 的表达 量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98 感染组（P0.05，P0.01，P0.01 ）；S.typhi-c-pRST98 感染组与 S.typhi-Δ-pRST98 感染组比较，CD和 CD86 的表达量均显著低于 S.typhi-Δ-pRST98 感染组 （P 均0.05 ）；S.typhi-WT 感染组和S.typhi-c-pRST98 感染组 DC 的吞噬率均显著高于S.typhi-Δ-pRST98 感染组 （P