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“原生质体的培养”一节研究性教学案例 　　中图分类号：G423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）37-0173-02 　　【教材分析】 　　高等植物细胞和动物细胞最大的区别在于外有一层细胞壁，原生质体是基础研究的理想材料，原生质体融合技术已成为作物改良的最有效的工具之一。在实现植物细胞融合之前必需获得再生能力强、活性高的原生质体，同时原生质体比较“脆弱”，培养条件和影响因素很多，因此通过这一节的学习要让学生掌握原生质体培养的方法和原理，原生质体培养过程中可能会出现的问题及如何解决。 　　【学情分析】 　　本科二年级已学过《细胞生物学》和《植物生理学》课程，对植物细胞的结构和植物细胞生长所需基本元素有所了解，这为本节教学奠定了基础。在此基础上，进一步了解原生质体培养方法、条件、注意事项等，为下一节“原生质体融合”课作好铺垫。 　　【教学目标】 　　知识目标：掌握原生质体的制备方法和培养条件。 　　能力目标：通过研究性教学和实践，加强学生对细胞工程实验原理和方法的迁移能力和创新能力的培养，提高学生动手和解决问题的能力，更好地适应社会的需要。 　　情感目标：在学生讨论与交流的基础上进行研究性教学，通过课堂讲授、提问、交流、讨论以及实验数据的分析等培养学生解决细胞工程教学中理论和实践相结合的能力，从而激发学生学习生物技术和细胞工程的兴趣。 　　【教学手段】 　　教师讲授、分组讨论、模拟实验和实验设计相结合的方法。 　　【教学重点】 　　原生质的制备以及培养条件。 　　【教学过程】 　　一、课前预习 　　1.什么是植物细胞培养？ 　　植物细胞培养是指在离体培养条件下，将植物愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，通过振荡培养分散成游离的悬浮细胞，继代培养使细胞增殖，获得大量细胞群体的一种技术。 　　2.植物细胞壁的主要成分是什么？ 　　（1）纤维素，占细胞壁干重的25%～50%不等；（2）半纤维素，平均约占细胞壁干重的53%左右；（3）果胶质，一般占细胞壁的5%。 　　二、课堂教学 　　【问题1】植物细胞和动物细胞不同，外面有一层细胞壁，如何获得去壁的裸露的植物细胞？这就是我们说的原生质体。 　　【学生讨论环节】 　　【老师小结】第一种方法是用机械切割的方法，第二种方法是通过酶解的方法。酶解方法的原理是植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质，使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶可以降解细胞壁成分，获得裸露的植物细胞，即原生质体。 　　【问题2】细胞壁对植物细胞有保护作用，如果用酶解的方法去除细胞外面的细胞壁，如何才能保持细胞不会破裂？ 　　【学生讨论环节】培养液中加入一种渗透稳定剂，保持原生质体膜的稳定，避免破裂。 　　【老师小结】是的，通常有二种方法来保持渗透平衡： 　　（1）糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等成分；（2）盐溶液系统：KCl、KH2PO4和MgSO4等成分。 　　【问题3】用酶学的方法获得原生质体取材的时候有什么考虑？ 　　【学生讨论】选取生长旺盛的组织来作为实验材料，如无菌试管苗叶片、下胚轴和子叶、培养细胞等。 　　【实验演示】原生质体制备过程和仪器设备 　　仪器和设备：离心机，无菌培养皿，离心管，无菌操作台。 　　试剂：酶液，洗液，液体培养基。 　　【研究探索】在原生质体分离过程中，有酶解、离心，如何检测收集到原生质体的活性？请同学们根据已有的知识，在讨论的基础上，写出你们的实验方案。针对下列问题开展讨论： 　　（1）如何设计实验方案？（2）如何测定原生质体的活性？ 　　【学生分组参与】 　　1.目测法：通过显微镜的观察，根据细胞形态和流动性来确定所分离的原生质体活力。 　　2.伊凡蓝法：伊凡蓝这种物质不能自由穿过质膜，只有当质膜受到严重损坏的时候细胞才能被染色，所以通过细胞是否被染色来确定分离的原生质体活性。 　　3.FDA法：二乙酸荧光素（FDA）是一种非极性化学物质，可以自由地穿越细胞质膜，在活细胞内FDA被酯酶裂解可以发出荧光，由于荧光素不能自由通过质膜，在荧光显微镜下通过观察具荧光的细胞来确定所分离的原生质体活性。 　　【问题4】影响所分离的原生质体活性的因素有哪些？ 　　【师生】结合上述分离方法，对影响因素进行分析 　　1.实验所用材料的生理状态和幼嫩程度； 　　2.酶解条件：酶的质量和浓度，酶解温度和时间，酶溶液的渗透压等； 　　3.分离条件：离心的次数和速度、纯化方法和分离所持续的时间长短； 　　4.环境条件：实验操作过程中环境的温度以及分离用具等。 　　【问题5】如何对收集到的原生质体进行计数？ 　　【生活实例】平时你感冒的时候医生要对你血细胞进行计数。 　　所