中国特有小型猪源性反转录病毒感染性克隆的构建与鉴定.pdfVIP

中文摘要 中国特有小型猪内源性反转录病毒感染性克隆的 构建与鉴定 中文摘要 异种移植，就是通过将动物器官、组织、细胞等移植到人体内，来解决机体 组织器官功能障碍并达到治疗的目的。而人源供体器官的严重短缺，就需要通过 异种移植作为替代途径解决。猪源器官的器官大小、生理学特点等都与人类相近， 被认为是最合适的异种移植供体。异种移植中除了各种排斥反应、组织器官相容 性等考虑外，最主要的担忧就是异种移植人兽共患病的跨种传播。研究发现猪内 源性反转录病毒(Porcine 细胞在内的多个细胞系，严重阻碍了猪一人异种移植的研究进程。 我国有着异常丰富的猪种资源，其中各种小型猪是适合医学实验研究和人类 异种移植的优良品种。目前我国的小型猪品系主要有：五指山猪、贵州小型猪、 广西巴马小型猪、版纳小型猪等。在解剖学特征、生理学特性、营养代谢等方面 与人类极为相似，非常适合用于人的异种器官移植，将来很有可能发展成为异种 移植的优良供体。本研究室在对我国主要小型猪PEIW存在及表达情况的研究中 发现，所有不同种系中均存在PERV，但病毒拷贝数不同，其中五指山猪基因组 中PERV的拷贝数较低，因而更适合于异种移植。 PERV以前病毒DNA形式整合到猪细胞基因组中，并随染色体的复制而复 制，因此无法从正常的细胞或组织中彻底消除。虽然大部分的研究结果均表明 PERV并不引起任何感染性疾病，而且PERV感染人源细胞后也没有发生细胞病 变，但这种隐性感染是否会如同其它反转录病毒一样通过潜在的与宿主细胞相互 作用引发肿瘤或者癌变?一旦猪源器官或细胞移植到高度免疫抑制的患者体内 时，PERV的跨种感染及表达情况又是如何?其潜在的病理效应仍然是个不可轻 视的问题。深入研究PERV分子生物学特性，能够了解病毒的生命调控过程，阐 明病毒感染、组装、整合机制，为研究PERV与宿主细胞间的相互作用、探索 PERV感染人源细胞后可能产生的效应奠定分子基础。 然而，由于RNA病毒体外操作困难，对反转录病毒的复制、组装和侵入分 子机制，病毒生活周期以及病毒与宿主细胞相互作用等的研究进展一直停滞不 前，直到二十世纪七十年代末，随着反向遗传学技术的推广以及感染性克隆技术 的广泛应用，IⅢA病毒的研究瓶颈得到突破并取得了诸多重大成就，该技术实 现了在DNA分子水平上对RNA病毒的体外操作，是用于研究病毒组成结构以 及生物学功能很好的方法，也称之为病毒拯救。在国外，目前已构建成功PERV．A、 3 中文摘要 PERV-B等多株不同猪种感染性克隆，并对其复制机制以及分子生物学功能进行 系统研究，而我国至今尚未见PERV感染性克隆构建的相关报道。 本研究以五指山来源小型猪为研究对象，构建五指山猪来源PERV感染性克 隆，为下一步研究五指山猪PERV分子生物学特性奠定基础。首先根据GeIlB锄k 上PERV序列(No．EFl33960)设计两对引物分别用于扩增PERV5’half和3’half IISK+载体特点，在5’half的5’端添加勋，I酶切 两个片段，并根据pBluescript 位点。3’half的3’端添加劢aI酶切位点，两片段重叠处均有PERV中唯一的NheI 酶切位点，首先通过PCR扩增得到五指山猪PERV前病毒全基因，根据基因克 sK+．、ⅣzS．PERV全基因克隆，并经菌落PcR和 隆和重组等技术获得pBlueS谢pt 酶切鉴定正确。根据此方法共构建9个PERV前病毒全基因克隆用于感染性克隆 析，结果发现仅有1个全基因克隆转染后细胞中有PERV三种结构基因的存在与 表达，将该克隆命名为WZS．PERV(2)。收集转染后的细胞培养上清，感染新 Qeen 病毒盲传6代，采用基于SYBR I的实时荧光定量RT．PCR方法对PERV m砌妊表达情况进行初步分析，结果均为阳性，此外，相对定量分析结构显示 各代次间PERV