新生大鼠心房肌胞kir3.1基因sirna的筛选与鉴定的实验研究.pdfVIP

目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………·1 英文论著摘要……………………………………………………………………·3 二、英文缩略语………………………………………………………………………·5 三、论文 前‘言…………………………………………………………………………………………………………．6日U青…………………………………………………………………………………………………………’ 材料与方法………………………………………………………………………·7 实验结果…………………………………………………………………………·l5 讨论………………………………………………………………………………………………………“18 结{念………………………………………………………………………………………………………”20 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………21 五、参考文献…………………………………………………………………………22 六、附录 综j盔………………………………………………………………………………………………………”25 在学期间科研成绩………………………………………………………………36 致谢………………………………………………………………………………………………………“37 个人简介…………………………………………………………………………38 ·中文论著摘要· 新生大鼠心房肌细胞Kir3．1基因siRNA的筛选与鉴定 的实验研究 目 的 心动过缓是临床上最常见的心律失常之一，人群发病率高，是威胁人类健康 和长寿的常见心血管病之一。其发生机制与迷走神经系统活性密切相关。心脏迷 白．乙酰胆碱敏感性钾电流通道，激活乙酰胆碱敏感性钾通道 muscarinic (Acetylcholine．sensitive 动作电位4位相最大复极电压绝对值增大，使心肌细胞自律性降低，导致心动过 缓的发生。KACh道由Kir3．1／Kir3．4基因共同编码的蛋白亚基组成。研究表明：该 通道的功能主要与Ⅺr3．1基因有关。本实验应用特异性小RNA干扰(Small interference 选出干扰效率最高的siRNA，并应用分子生物学方法进行鉴定，为今后将RNA干 扰技术引入心动过缓机制的研究及基因治疗心动过缓提供新思路。 方法 体外人工合成3对针对飚r3．1基因的siRNA寡核苷酸片段，分别转染至心房 肌细胞。应用荧光定量聚合酶链反应(Real．time Chainreaction，Real．time Polylneras PCR)方法筛选出抑制率最高的siRNA，并将其转染至原代培养的新生SD大鼠 心房肌细胞，收集空白组细胞以及转染后24h，48h，72h，96h的细胞，分别利用 Real—timePCR、蛋白免疫印记(Westernblot)检测Ⅺr3．1mRNA和蛋白质的表达。 勿七 甲 耋日7尺 (1)酶消化法培养的大鼠心房肌细胞纯度和活力均高，72h后体外培养的新 生鼠心房肌细胞生长密度可达瓶底70％，并出现细胞簇的同步搏动，免疫荧光法 检测心肌细胞纯度达90％以上；(2)人工合成的siRNA转染新生鼠心房肌细胞对 基因抑制率最高的～组siRNA，其KACh的表达在mRNA水平和蛋白水平均降低， 并呈现时间依赖性。24h时Kit3．1 mRNA表达量开始下降，为对照组的(564-1)％； 48，72 96 blot检 测发现，48及72h后转染组站r3．1蛋白水平较对照组明显下降，分别是对照组的 (374-3)％和(194-2)％(氏0．01)。