酪蛋白源新型抗高血压活性肽分离、纯化及其生理活性和结构鉴定.pdf

上海交通大学博十后报告 酪蛋白源新型抗高血压活性肽的分离、纯化及其 生理活性和结构鉴定 摘要 近年来，随着人们生活水平的提高 高血压的发病率也呈上升趋势，全世界 大约有20％的成年人受此威胁，因此，源于食品抗高血压肽的保健功能研究愈 加引起广泛关注。 酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，结构比较开放、松散，易受多种蛋白酶的作 用而发生水解。本实验选用食品级微生物蛋白酶A和B分别水解酪蛋白，而且 水解时产生较多的切割位点，可以达到较高的水解度。通过改变酶的浓度进行水 解，水解效果较好，水解度达到20％以上，水解后形成的肽段的平均含有2—5个 氨基酸残基，但水解后样品中的灰分含量较高，一般为14％左右，严重影响了 水解样品的品质和活性的分析研究，必需进行脱盐处理。同时水解物进行 RP．HPLC分布的结果显示酪蛋白水解后形成很多肽的混合物，成分复杂，需要 进一步分离纯化。 采用大孔吸附树脂对蛋白溶液进行脱盐处理行之有效的方法。本实验通过筛 选利用DA．201C对酪蛋白酶解液的脱盐是最佳的，而且70％乙醇溶液为洗脱剂 时洗脱率和脱盐率均较高，而且水解样品经脱盐处理后大部分的ACE抑制活性 升高，特别是8号样品脱盐后的活性升高幅度较大，达到80I％，并且RP—HPLC 检测，脱盐后达到了脱盐和纯化的目的，但是其中的成分还是很复杂。 大鼠灌胃，6小时内降压效果强烈；1000mg／kg的剂量对SHR大鼠有极显著的降压 效果，500mg／kg的剂量亦对SHR大鼠有显著的降压效果。因此8号脱盐样品在 体外有较强的ACE抑制活性，在体内动物实验也具有较强的抗高血压活性，表 明脱盐后样品为含有抗高血压活性肽的混合物。 采用分子排阻的凝胶色谱、RP．HPLC方法对8号脱盐样品进行分离纯化，经 其中8一V和8一Ⅵ组分具有较强的ACE抑制率，分别达到72．6％和75．5％，因 此将对8一V和8一Ⅵ作进一步分析与分离。经RP．HPLC检测分析，8一Ⅵ组成 成分复杂，而8一V峰样品在检测波长220rim和280nm都显示主要两个组分峰， 分别为P1和P2，其氨基酸组成中含有芳香族氨基酸。检测P1和P2组分对ACE 活性抑制率，分别达到84．4％和79．6％，采用RP—HPLC检验纯化效果，这两个 组分都只含有一种肽。 果强烈，以后大鼠血压渐渐升高趋势，8一V号样品在连续9天灌胃SHR大鼠后 卜海交通大学博士后报告 SBP的的测量结果，统计结果样品组和对照组比较有极显著差异(P0．01)，说 明8一V所含有的两个组分Pl和P2是具有较强作用的抗高血压活性肽。 采用LC—ESI．MS对8．V样品进行分子量和序列的初步分析，在此基础上又 量和序列的进一步确定，8一V样品进入HPLC分离结果，主要峰为P1和P2，分别 选择Pl和P2进行质谱鉴定和高级分析软件Biolynx分析，软件推导氨基酸序列 P1为 上查找和大量资料的查阅对比，没有找到序列相同的抗高血压肽，因此该两种肽 为新型抗高血压肽。 总之，本研究以酪蛋白为原料通过微生物蛋白酶降解后，分离纯化得到两种 新型抗高血压活性肽，同时建立体内和体外功能检测模型跟踪其对ACE抑制活性 和抗高血压效果，并进行多肽的分子量和一级结构的测定，为食品蛋白质的开发 利用和多肽药物的研究奠定理论和实验依据。 关键词： 酪蛋白 抗高血压活性肽 纯化 生理活性 结构检测 Abstract and Identificationof Separation，Purfication from Casein AntihypertensiVePeptides ABSTRACT essentialaminoacidforindividual Casein，w