5-aza-cr对hs888t骨肉瘤细胞增殖、凋亡及apaf-1基因表达的影响.pdfVIP

前一言………………………………………………………………………………”／ 刖舌……………………………………………………………………………… 实验材料与方法…………………………………………………………………8 实验结果…………………………………………………………………………lO 讨论………………………………………………………………………………11 结论………………………………………………………………………………13 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………14 五、参考文献…………………………………………………………………………15 六、附录 综j盎……………………………………………?………………………………一16 在学期间科研成绩………………………………………………………………23 致谢………………………………………………………………………………24 个人简介…………………………………………………………………………25 ·中文论文摘要· APAF．1基因表达的影响 目 的 骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，进展迅速， 然而骨肉瘤的发病机制尚未清楚。表观遗传学中DNA甲基化介导的基因沉默是肿 瘤中常见的基因变异。APAF-1基因位于染色体12q23，是在线粒体凋亡途径中p53 下游的关键成分，是凋亡的核心。在多种肿瘤和细胞系中发现了APAF．1基因甲 甲基化。本实验拟检测DNA甲基转移酶抑制剂5．氮杂．27脱氧胞苷(5．Aza．CdR) 处理前后骨肉瘤细胞Hs888T的细胞增殖、周期及Apaf-1蛋白表达水平变化，探 讨5-Aza．CdR在骨肉瘤发生、发展的作用及机制。 方法 l、主要试剂 Cruz公司。 2、细胞培养及药物处理 and0．3mmol／L) 空气培养箱中。培养24小时候后用不同浓度的5-Aza．CdR(0、0．1 处理48h、96h后收集细胞进行实验。 3、四唑盐(MTT)比色法检测Hs888T增殖活性 取对数生长期的细胞，按1x103／1009l细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞 悬液2001．tL。实验组和对照组分别设6个复孔。分别培养44h、92h后倾去培养基， 各孔加入59in的MTT201ttL继续培养4h。选择570nm波长，在酶标仪上测定各 孔光吸收值(A)。 4、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡水平 oc固定过夜，RNaseA37℃孵育30min后， 收集处理的各组细胞，70％冰乙醇4 及细胞凋亡率。 5、Westem blot法检测细胞Apaf-1蛋白表达水平 电泳后转移到PVDF上，用5％脱脂奶粉液室温下封闭2h。加一抗4。C过夜，TTBS 液洗膜两次后加入二抗37。C孵育1h。膜经ECL发光试剂处理后检测蛋白表达情况。 6、统计分析 forWindow 资料比较采用t检验，利用SPSS 16．0进行统计分析。P0．05有 统计学意义。 多士 田 昌曰 木 Hs888T细胞增殖受到不同程度抑制，通过流式细胞术碘化丙啶PI单染结果我们 度依赖性。Westem 的增加APAF．1蛋白的表达逐渐增强，APAF．1蛋白表达的变化可能是参与 5-Aza．CdR抑制Hs888T细胞增值的机制之一。+ 匀习结论◆己 期，促进Hs888T细胞分化和诱导其凋亡，并能上调APAF．1基因蛋白的表达，其 作用机制可能是5-Aza．CdR使APAF．1等抑癌基因去甲基化而重新激活表达，从 而达到抑制肿瘤生长。 关键词 5．氮杂．2’脱氧胞苷；APAF．1基因；骨肉瘤；Hs888