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pEGFP介导的ING4基因对U251 细胞株增殖及凋亡的影响 专 业：神经外科学 硕士研究生：雷炳喜 导 师：邓跃飞副教授 摘要 一、研究背景 胶质瘤是一种最常见的颅内恶性肿瘤，占所有原发性颅内肿瘤的 40¨0％，年发病率为10／10万，绝大多数恶性程度较高，预后较差。恶性胶 质瘤平均存活期仅为9_12个月，5年生存率低于5．5％。恶性胶质瘤由于其浸润 性生长，易于复发，所在区域功能重要等原因，治疗效果很不理想。目前胶质瘤 的治疗仍然是以手术切除为主，辅以放疗化疗的综合治疗。在胶质瘤的临床基础 研究方面，基因治疗仍然是研究的热点。基因治疗主要由三个核心部分组成，即 目的基因、基因载体系统和基因表达系统。选择有效的转移基因显然是取得良好 治疗效果的最重要因素。 胶质瘤的病因迄今为止尚未完全明确，是一个涉及多基因的过程，主要与遗 传因素、胚胎发育因素、物理化学因素、病毒感染因素等密切相关。胶质瘤发病 机制复杂，涉及癌基因的活化和抑癌基因的失活、细胞的瘤变、凋亡抵抗、自主 生长信号的产生、新生血管的出现、免疫逃避、侵袭性的获得等等。抑制胶质瘤 增殖、细胞毒作用、诱导胶质瘤凋亡以及抑制胶质瘤血管生成是胶质瘤治疗的主 要方法和途径，相关基因也是基因治疗研究的重点。 近年来研究发现，生长抑制因子4(ING4)基因在抑制肿瘤生长、促进肿瘤凋 亡、恢复细胞间的接触抑制、影响细胞周期进程、抑制肿瘤血管生成、增强肿瘤 对细胞毒药物的敏感性等方面有重要作用。ING4基因定位于12p13．31，由8个 Ⅱ pEGFP介导的ING4基因对U251细胞株增殖及凋亡的影响 747bp，编码约249个氨基酸残基，具有核定位信号以及C末端高度保守的PHD 锌指结构域。研究发现，ING4表达水平与胶质瘤的恶性程度成反比，不同级别 的胶质瘤的ING4表达具有明显差异。这说明ING4基因可能与胶质瘤的发病机 制密切相关，因此研究ING4基因对胶质瘤的治疗作用及其机制具有重要意义。 ING4基因是否能抑制胶质瘤增殖、诱导其凋亡目前需要解决的首要问题。 目前，广泛使用的基因表达系统之一是pEGFP质粒，pEGFP质粒含有GFP 基因和卡那霉素／新霉素抗性基因，能在真核细胞中表达绿色荧光蛋白GFP和卡 那霉素／新霉素抗性。因此，在转染后，可以通过G418筛选和GFP流式细胞分 选系统筛选，获得阳性转染株。构建携带ING4的真核表达载体是研究该基因功 能的基础。pEGFP质粒介导的目的基因可以实现在宿主细胞中的高表达，从而 达到基因治疗的目的。 二、研究目的 1．构建携带ING4基因的真核表达载体pEGFP—ING4； 2．pEGFP-ING4转染U251，筛选阳性克隆； 1中的表达： 3．分析ING4在pEGFP—ING4转染的U25 4．探讨pEGFP-ING4对U251细胞株的增殖、凋亡的影响； 三、实验方法 1．生物信息学分析ING4基因：运用ORF Conserved Domains在线软件对ING4进行开放读码框分析、亚细胞定位 分析、跨膜区分析、信号肽分析、结构域分析。 Primer5、PCR 2．重组质粒pEGFP．ING4的构建：①运用Premierdesign软 载体上，转化、扩增、提取质粒，酶切鉴定。④双酶切阳性TA克隆质 粒和pEGFP载体，电泳后切胶回收。将目的片段和pEGFP载体连接， 转化、扩增、提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定。 III 旦曼鱼E旦金量盟型Q兰垫圈麴望!!!塑墅丛塑堕壁塑圭塑墅咆 筛选GFP阳性及卡那霉素／新霉素抗性U25