兔骨髓间充质干胞分化为角膜上皮样细胞的体外研究.pdf

·中文论著摘要· 兔骨髓间充质干细胞分化为角膜 上皮样细胞的体外研究 目 的 角膜上皮层是覆盖角膜表面的复层上皮组织，对于维持眼表的健康和稳定具 有重要作用。正常状态下，角膜上皮细胞可以不断的脱落、更新；外界因素引起 的角膜上皮损伤也可很快修复。角膜上皮层的自我修复有赖于角膜缘基底层的成 体干细胞——角膜缘干细胞(Limbalstemcells，LSCs)。 cells stem 当角膜缘受损，引起角膜缘干细胞缺乏或功能缺陷(Limbal 管长入和假性翼状胬肉形成等一系列病理改变，给患者带来巨大的痛苦，甚至最 终导致失明。随着对LSCs研究的深入和发展，相继出现了一系列针对上述疾病 的治疗方法，包括：羊膜移植、自体角膜缘移植、异体角膜缘移植及培养LSCs 移植等。但是对于严重的LSCD，特别是双眼LSCD，目前还没有十分有效的治疗 方法，因此探讨应用其他干细胞系重建LSCs缺乏性眼表是目前亟待解决的问题。 stem cells，MSCs)是来源于胚胎发育早期 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal 中胚层的一类多能干细胞，主要存在于骨髓，由于其高度的自我更新能力和多向 分化潜能而受到广泛的关注。大量文献研究表明在适当条件下，MSCs不但可分 化成骨、软骨、脂肪和肌肌肉等中胚层组织，还可以分化成脑、皮肤、视网膜等 其他胚层的组织。这种跨系分化被称为转分化。研究证明MSCs可以分化为皮肤， 肺及其他组织的上皮细胞，而近期研究发现将体外培养的人MSCs移植到损伤的 兔或鼠角膜表面，可以重建损伤眼表，其治疗作用主要与抑制炎症反应和新生血 管有关。这些研究结果提示MSCs在角膜组织损伤修复中具有潜在的重大应用价 值。 为检测MSCs是否可以分化为角膜上皮细胞，我们用含有兔MSCs的胶原膜 重建兔损伤眼表，结果显示移植的兔MSCs到达角膜上皮基底层，并表达角膜上 3)(已投稿)，说明MSCs具有 皮细胞的表面标记抗原细胞角蛋白3(cytokeratin 向角膜上皮细胞分化的可能。 但目前关于MSCs向角膜上皮细胞诱导分化的研究还十分有限；并且由于细 胞融合现象的发现，人们对于MSCs多向分化的可塑性存在一定争议。因此进一 步研究MSCs向角膜上皮细胞分化的可行性，及这一过程中可能的参与因素具有 重要意义。 为此本研究利用不同体外环境诱导培养MSCs，初步证明MSCs可以在体外 诱导分化为角膜上皮样细胞，并且在这一分化过程中表皮生长因子(Epidermal growth 以分化为角膜上皮样细胞，为眼表疾病的细胞替代治疗提供了新的理论基础。 方 法 1、 无菌条件下取兔骨髓，用密度为1．073的percoll淋巴细胞分离液密度梯 度离心法(8009，30分钟)分离骨髓单核细胞层，DMEM培养基重悬细胞，以 培养基培养24小时，以获得BrdU标记的兔MSCs。 2、 无菌条件下环形取1．5～2mm兔角膜缘组织，撕去角膜内皮层， 37 II酶4C消化18小时后，取角膜上皮层用0．25％胰酶+0．02％EDTA 0．25％Dispase ℃消化10分钟，1000转离心lO分钟后，SHEM培养基重悬接种于6孔培养板 内，37C、体积分数5％C02孵育箱中培养，正常换液、传代。 3、 用流式细胞技术检测培养MSCsCD29、CD34表达情况。 4、 用免疫荧光染色法检测培养的兔LSCs CK3、IntegrinDl和p63的表达情 况。 5、 取BrdU标记的