巴什拜羊iBPIi基因的克隆与真核表达.pdfVIP

江苏农业科学　２０１５年第４３卷第９期 — ３９— 陈冬梅，沈　文，刘　恺，等．巴什拜羊ＢＰＩ基因的克隆与真核表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１５，４３（９）：３９－４２． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１５．０９．０１０ 巴什拜羊ＢＰＩ基因的克隆与真核表达 １ １ ２ １ ３ １ 陈冬梅 ，沈　文 ，刘　恺 ，郭海英 ，陈凯丽 ，孙延鸣 （１．石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３；２．新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物园，新疆乌鲁木齐８３００９４； ３．石河子大学生命科学学院，新疆石河子８３２００３） 　　摘要：从巴什拜羊外周血多形核粒细胞（ＰＭＮ）中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出巴什拜羊ＢＰＩ基因片段，将其 克隆至ｐＰＩＣ９Ｋ载体中，构建真核表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ－ＢＰＩ，经ＰＣＲ、酶切及测序鉴定正确后，电转化至毕赤酵母 ＧＳ１１５ 中并用甲醇诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定重组 ＢＰＩ蛋白的表达，通过微量肉汤稀释法检测重组 ＢＰＩ蛋白的抑菌活性。 结果表明：ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得５９７ｂｐ巴什拜羊ＢＰＩ基因；经ＰＣＲ、酶切及测序鉴定证实成功构建ＢＰＩ基因的真核表达载 体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，重组ＢＰＩ蛋白成功表达，通过抑菌试验表明表达的重组ＢＰＩ蛋白具有明显抑菌活性。 　　关键词：巴什拜羊；杀菌性；通透性增加蛋白；毕赤酵母；基因克隆；真核表达 　　中图分类号：Ｑ７８５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１５）０９－００３９－０４ 　　我国是养羊大国，新疆维吾尔自治区是我国主要的绵羊 中和脂多糖ＬＰＳ，并且减少致炎细胞因子ＴＮＦ－ 和巨噬细 α ［１３］ 生产基地，巴什拜羊是新疆乃至国内外不可多见的绵羊地方 胞炎症蛋白－２（ＭＩＰ－２）的产生 。但有关羊ＢＰＩ基因的 ［１］ 优良品种，具有特殊的生物学特性 ，原产自新疆维吾尔自 功能还未见报道。本试验从巴什拜羊外周血中提取多形核粒 治区裕民县。该羊具有生长发育速度快、生产性能高、抗病力 细胞ＰＭＮ总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ获得ＢＰＩ目的基因片段，构 强等特征，其羔羊成活率达９５％以上，是发展我国重要的羊 建巴什拜羊ＢＰＩ真核表达载体，并对其表达产物进行生物活 ［２］ 品种资源 。杀菌性／通透性增加蛋白（ＢＰＩ）主要存在于人、 性检测，旨在为进一步深入研究巴什拜羊重组ＢＰＩ蛋白的生 哺乳动物的多形核粒细胞（ＰＭＮ）嗜天青颗粒中，是 ＰＭＮ的 物学功能奠定基础。 主要抗菌成分［３－５］，具有杀菌、中和内毒素以及促进补体活化 １　材料与方法 增强调理功能的作用。Ｖａｎｄｅｒ等发现，ＢＰＩ蛋白可以诱导血 管内皮细胞的凋亡，抑制血管生成，在体外血管生成试验中， １．１　试验动物、菌株与载体 在１．８ ｍｏｌ／Ｌ浓度下作用２４ｈ后ＢＰＩ蛋白能够抑制８１％的 　　本试验所用的５只巴什拜羊由石河子大学动物科技学院 μ 血管生成，这一发现使 ＢＰＩ蛋白有望用于治疗癌症或与血管 试验站提供。巴斯德毕赤酵母 ＧＳ１１５菌株及表达载体 ［６］ ［７］ 形成有关的疾病 。ＢＰＩ蛋白在抗真菌感染 、抗弓形虫感 ｐＰＩＣ９Ｋ为新疆农垦科学院兽医研究所薄新文研究员馈赠， ［８］ 染 等领域也有非常重要的意义。２００５年，美国食品药品管