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第九章 生物芯片及数据分析技术 上世纪70年代，美国投入巨资的“肿瘤计划”搁浅，人们渐渐认识到，包括癌症在内的各种人类疾病都与基因直接或间接相关。 1984年，美国能源部（DOE）首次探讨人类基因组DNA进行全序列分析的前景 1986年美国生物学家、诺贝尔奖获得者杜尔贝科(R. Dulbecco) 在《science》发表《癌症研究的转折点——测定人类基因组序列》（“人类基因组计划的标书” ）得到热烈响应。 1990年10月1日，人类基因组计划正式启动。 2001年2月，人类基因组序列“工作框架图”公布 2006年5月，最后一条染色体序列被公布 2008年1月，个人基因组计划启动 传统核酸印迹杂交的局限性 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等 生物芯片技术 定义：是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖类甚至组织切片和细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、滤膜等载体）的表面，组成高度密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样本中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 基本环节： 芯片制作 样品制备 分子杂交 检测分析 DNA芯片技术的应用 利用DNA芯片进行杂交测序的原理 杂交测序技术（SBH）可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。 1、差异基因的筛选 倍数差异FoldChange=SignalA/SignalB（即待比较的两个标准化以后的信号相除所得的值） ——常用标准Ratio（0.5，2.0） 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片探针及其标记 根据研究目的不同，蛋白芯片的探针可选用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。 探针的标记主要有： 酶标记（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP） 荧光标记（常用Cy3和Cy5） 化学发光物质标记（如吖啶酯）等 分子间的反应 主要有： ①抗原抗体反应 ②蛋白质分子与其它蛋白分子或与核酸分子之 间的特异性识别结合 ③酶与底物的识别等 通过优化合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，可以减少生物分子之间的错配比率。 蛋白质芯片信号的检测 对吸附到蛋白质芯片表面靶蛋白的检测主要有两种方式 ： 1、以质谱技术为基础的直接检测法〈如表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI - TOF - MS)〉 2、蛋白质标记法： ①荧光标记的芯片既可用激光共聚焦检测，也可用电荷偶联照像系统（CCD）进行检测 ②酶标芯片显色后用高精度的CCD进行检测 常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱，再经相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。 蛋白质芯片在医学中的应用 特异性抗原抗体检测 酶活性等生化反应检测 临床检验和疾病诊治 毒理学研究、药物筛选等 疾病诊断 1、用于诊断遗传性疾病 例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片 2、用于病原体的检出和确定 例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。 3、肿瘤的基因诊断 ? 例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。 药物筛选 利用DNA芯片技术可比较正常组织（细胞）与病变组织（细胞）中大量相关基因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。 表达谱芯片是DNA芯片中最常用的一种芯片。 Affymetrix基因表达谱芯片的实验流程 生物信息学分析 ——基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是一种相对值。不同芯片之间要经过以看家基因作为对照的标准化处理才有可比性。 常用GAPDH或β-actin基因 归一化的数据 显著性差异p值：进行统计学t检验，p0.05为显著性差异，p0.01为强显著性差异 ——生物学重复不少于3个 每个探针点的Flag值/Call值：表达谱芯片中常用A、P、M来表示该探针点信号与背景信号的差异 ——A-Absent：无显著性差异 P-Present：有显著性差异 M-Marginal：差异介于A和P之间 ——要求比较的两组，至少有一组内不出现A 火山图（Volcano plot） 散点图（Scatter plot） 视图分析 聚类分析将基因与最相关的