治疗性抗体通用核表达载体的构建.pdf

中文摘要 治疗性抗体通用真核表达载体的构建 摘要 研究背景 恶性肿瘤严重危害人们的健康，据wHO统计，在全世界50多亿人口中平 均每年死于恶性肿瘤者达690万人，新发病例为870万例，且数字还在逐年增 加。在我国，根据卫生部2004年公报资料，2003年恶性肿瘤仍稳居我国部分 市县疾病死因之首。 淋巴瘤起源于淋巴结或其他淋巴组织，分为霍奇金病(HodgkindiseaSe，HD) 最为常见。 在本篇论文中主要涉及到B细胞性非何杰金氏淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤 是一种常见的恶性淋巴肿瘤，治疗非何杰金氏淋巴瘤有很多常规方法，以放疗 和化疗为主，但放疗和化疗毒副作用大且选择性不强，在杀伤肿瘤细胞的同时， 对正常组织细胞也有毒害作用，而且很容易产生内在性或获得性多药耐药 resistance， NHL (Multi．dmg MDR)和复发，并且对中度和高度恶化的B．ceu 的缓解率很低。因此只杀伤肿瘤细胞而正常细胞不受损害的靶向治疗一直受到 关注。单克隆抗体因其特异性高，本身具有细胞毒作用，可携带药物，毒物和 放射性同位素而成为靶向治疗的主要策略。 目前肿瘤的单克隆抗体导向治疗是一个研究十分活跃的领域，且取得了可 喜的成果。对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单克隆抗体导向治疗就是一个较为成功 的例子，目前临床治疗效果最好的还是抗CD20抗体。 但由于抗体片段Fab’及F(ab’)2是抗原结合活性片段，缺少Fc段细胞生 物学功能，且Fab’及F(ab’)2的分子量较小，因此血浆半衰期比较短，影响 了它的疗效。 目的 本实验主要构建用于表达治疗B淋巴细胞非何杰金氏淋巴瘤的抗CD20基 因工程抗体的真核表达载体。研制的该抗体片段己拥有我国独立知识产权，与 国外同类产品相比有以下优势：基因工程抗体片段诱导肿瘤细胞凋亡作用更强； 与CD20抗原结合的表位不同，可能在抗B—ceUNHL耐药方面更具有优势，研 制成功后有望取代国外同类产品。真核表达载体的优势在于：真核中抗体蛋白 中文摘要 可正确折叠和糖基化，产生更接近人的结构分子，将有更好的活性；因为全抗 大分子在原核中产量较低，因此在真核表达，相对于原核，产量将有所提高。 研究方法 主要通过基因工程及分子生物学方法，采用PCR手段，分别合成全抗体的 轻链和重链，通过限制性内切酶酶切，利用5’和3’的黏性末端，连接等方法， 将抗体片段导入真核表达载体质粒PEEl4中，转化入感受态细胞，涂于含有锄p 的琼脂糖凝胶的平板上，过夜生长然后通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定出含有 导入质粒的阳性菌株，交由生物公司测序。然后通过构建的分别含有抗CD20 全抗体轻链和重链的PEEl4质粒，通过多克隆接头，改造PEEl4质粒，消除 sal I位点，加入notI位点，然后通过中间载体pcdna3．1，将轻链和重链基因同 时转入同一真核表达载体PEEl4中。 结果 构建了分别含有抗cD20全抗体轻链和重链的PEEl4质粒； 改造了pcdna3．1过渡载体，去掉了一个SalI位点，加入了NotI位点。 构建了抗cD20全抗体轻链和重链同时在一个表达载体上的PEEl4质粒， 有两套顺序，一套为轻链在前，重链在后；另一套为重链在前，轻链在后。 结论 为下一步将载体导入到CHO细胞系中，与脂质体共转染做准备。 关键词： cD20真核载体表达质粒PEEl4 ． II AbStract Background Inrecent fornHnorwereconcemedinclinic．In years，antibodytherapies a11d thea11tibodieswith have field，