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中山大学硕士论文 OprD和青霉素结合蛋白在铜绿假单胞菌对皿胺培南耐药tfl的作用 OprD禾l：l青霉素结合蛋白在铜绿假单胞菌 对亚胺培南耐药中的作用 专 业：临床检验诊断学 硕士研究生：姜余琴 指导教师：曹开源副教授 中文摘要 研究背景： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)属于革兰阴性需氧菌，是人体 最常见的条件致病菌之一，当机体免疫力低下或者机体的完整物理屏障受到破坏 的时候，铜绿假单胞菌可引起非常高的发病率，其在医院获得性感染中占有非常 重要的地位。近年来，由于铜绿假单胞菌分离率高及时常的爆发流行，并且对多 种抗菌药均产生耐药，治疗极其困难，越来越受到广大医护人员的重视。 以亚胺培南(1mipenem，IPM)为代表的碳氢霉烯类抗菌药是最近研制开发 的广谱13．内酰胺类抗生素，对铜绿假单胞菌有较强的杀菌力，是近年来治疗严重 铜绿假单胞菌感染的最主要药物。然而，随着碳青霉烯类抗生素的大量临床应用， 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌在世界范围内均有报道，并且耐药率有逐年上升的趋 势。目前认为铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药耐药机制主要有：1．13．内酰胺酶 的水解作用，主要是金属p．内酰胺酶(MBLs)：2．特异性外膜孔蛋I兰tOprD基因突 变、表达量降低或完全缺失均可致外膜通透性降低，使得碳青霉烯类抗生素，尤 中山大学硕士论文 OprD和青霉素结合蛋白在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中的作用 其是亚胺培南难以进入菌体内发挥作用；3．作用靶位(青霉素结合蛋白)的改变 导致抗菌药物与之亲和力降低：另外，还有主动外排系统的高表达和生物膜的产 生等可能的耐药机制存在。 本实验室前期部分研究成果提示：铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一 ——金属13-内酰胺酶的产生在广州地区亚胺培南耐药的铜绿假单胞中所占的比 例为13．4％，其它大多数耐药菌株中并未发现金属B．内酰胺酶的产生，而且金属 酶产生与菌株对亚胺培南的耐药程度不平行，说明该类菌株存在除此机制之外的 其它耐药机制。 目的： 1．了解铜绿假单胞菌对常见抗生素的耐药情况及其耐药谱特征，以指导临 床合理选用抗生素； 2．明确外膜孔蛋白OprD的基因突变、表达减少或缺失是否是广州地区铜绿 假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一； 3．明确青霉素结合蛋白的改变是否在广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南的 耐药中发挥作用。 方法： 的纸片扩散法进行药敏试验； 2．采用实时荧光定量PCR法对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌及对照株进行 OprD基因相对定量及分析； 3．设计合成针对OprD编码区基因全长的引物序列，对OprD表达升高的菌 株进行PCR扩增，并对PCR产物进行DNA测序、后续比对和三维结构预测分 析； 盒在内的引物序列，采用PCR技术进行基因扩增，并对PCR产物进行DNA测 序分析。 U 中山大学硕士论文 OprD和青霉素结合蛋白在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中的作用 结果： 1．细菌药敏试验结果显示，168株铜绿假单胞菌对下列抗生素的平均耐药率 左旋氧氟沙星(17．26％)、氨曲南(14．88％)：其中亚胺培南耐药的有49株，而 且大多数为多重耐药菌株； 2．49株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中15株未检测到OprD基因的表达，27 株OprD相对表达量较对照株降低，表达减少或缺失的占85．7l％，7株铜绿的 OprD相对表达量较对照株升高。本地区7株之间OprD基因同源性高，其中6 菌株的OprD基因与北非和意大利分离株的OprD基因同源性较低。三维结构预 测表明，其中2株有较明显的外膜孔蛋白通道的变窄； 3．青霉素结合蛋白编码基因PCR产物测序结果与铜绿假单胞菌标准对照株 PAOI相比未发现保守区SXXK盒及其周围的氨基酸改变。 结论： 1．2005年--2007年广州地区铜绿假单胞菌整体耐药现象严重，对亚胺培南 的耐药率较高，而且大多数为多重耐药菌； 2．外膜孔蛋白OprD的改变是广州地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重 要机制之一