tryptas诱导aml骨髓基质细胞高表达vegf及机制的研究.pdf

IlUll／I／／l／／／I／I／lllll／／JI／I／／lll／／／llll／II／f／lll ／丫1769678 目 录 ·中文论著摘要· 制的研究 目的 急性髓细胞白血病(Acute Leukemia，AML)是血液系统常见的恶 Myeloid 性肿瘤，以幼稚粒细胞克隆性增生且不伴有明显的分化为特征，临床分为多种亚 型，大部分亚型的发病机制仍不十分清楚。类胰蛋白酶(Tryptase)是一种具有多 种生物学效应的丝氨酸蛋白酶，目前被作为AML发病和临床监测过程中的一种 新酶类而受到了人们的关注，以往被普遍认为主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞 (嗜碱性粒细胞产生少量)产生的。随着对tryptase广泛和深入的研究，发现在 展中的作用目前仍不十分明确。 达均明显增高，且二者之间具有显著相关性。最近研究还发现，tryptase阳性的肥 大细胞计数与许多恶性肿瘤和炎症的血管新生程度成正相关，可以促进多种肿瘤 细胞和炎症细胞表达VEGF，并可作为判断恶性肿瘤患者预后的指标。这说明 tryptase可能在AML血管新生中起着一定的作用，这种作用可能与VEGF有关， 目前国内外尚未见相关报道。 导，将细胞外的信号传递到细胞内。以往对多种细胞的研究表明，PAR．2可通过 多种途径介导细胞内信号转导，但近年来研究主要集中在丝裂原活化蛋白激酶 通路有关。NF．K B是重要的转录调节因子，可作为ERK和p38MAPK信号通路 的下游信号分子，被激活后可引起相应靶基因的转录激活，以往的研究表明VEGF 的表达与NF．KB也有着密切的关系。 BMCs表达 BMCs后是否上调VEGF的表达，并进一步探讨tryptase促进AML B，使其转位到 (ERK和／或p38MAPK)信号转导通路，激活转录调节因子NF．K 核内，促使VEGF表达增加。 方法 1、细胞培养及鉴定：骨髓肝素钠混合液5ml，加入lOml淋巴细胞分离液， 2000rpm，离心10min，取单核细胞层，接种于25ml培养瓶中，15％胎牛血清， DMEM／F12中，培养箱常规培养。根据细胞形态学和流式细胞术检测细胞表面 1 BMSCs。 CDl4，CD34，CD45，CDl3和CDl7表达情况，鉴定所培养的细胞为AML BMSCs共同孵育后检测VEGF的表达情况：以0～50 2、重组tryptase与AML BMSCs，应用MTT的方法检测细胞活性，从而挑 ng／ml的tryptase作用于AML 选tryptase的最佳作用浓度。以不同浓度(0．5，5，10 ng／m1)的tryptase作用于 AMLBMSCs，分别用ELISA、免疫荧光、realtime 法检测VEGF的表达情况。 3、以U937细胞的培养上清培养AMLBMSCs，检测VEGF的表达：以 BMSCs24 time 体作为培养基。培养AML h后，应用realRT-PCR方法检测AML BMSCs48 BMSCs中VEGFmRNA的表达；培养AML h，应用ELISA方法检测 上清液中VEGF的表达情况。 BMSCs表面PAR．2的表达：用胰 4、免疫细胞化学和流式细胞术检测AML 酶将AMLBMSCs从细胞培养瓶上消化下来，制成细胞爬片