碱性成纤维细胞子对皮肤干细胞神经分化影响的研究.pdf

b-FGF 对表皮干细胞神经分化的影响研究 摘要 目的： 探讨表皮干细胞向神经细胞分化的影响因素。 方法： 1.分离3-4 天的SD 大鼠表皮基底层细胞，利用 10分钟贴壁法分离出表 皮干细胞。2, 用免疫组织化学法测定K15、β1整合素、CD34 和巢蛋白（nestin） 来鉴定培养出的表皮干细胞。3. 加入不同的培养基：K-SFM、NEUROBASALTM-A 和DMEM 培养分离出的表皮干细胞，并观察不同培养基组细胞形态的变化。 4. 通过调整不同浓度的bFGF，观察表皮干细胞的形态变化。5.用K-SFM 为培养基 培养表皮干细胞，以表皮干细胞的细胞密度分组，分为0.5×107/ml 组、0.3× 107 7 5 /ml 组、0.1×10 /ml 组、0.5×10 /ml，每组均加入20ng/ml 的bFGF，观察其 细胞形态发生以及细胞标记物的改变。 结果： 1.利用十分钟贴壁法成功分离出表皮干细胞。分离出来表皮干细胞细胞密度 大，细胞呈圆形或多角形，细胞形态清晰，胞质均匀，可见有核分裂细胞，核质 比例大，其特征性标记分子K15 及β整合素表达阳性。 2.表皮干细胞在NEUROBASALTM-A 和DMEM 培养基中均出现细胞体积增大，细 胞膜边界不清，细胞核溶解、核碎裂、细胞死亡。 3.表皮干细胞在K-SFM 培养基中，加入bFGF 的浓度为0ng/ ml、 5ng/ml、 10ng/ml、15ng/ml时，细胞形态没有明显改变，呈圆形或多角形，细胞形态清 晰，胞质均匀，可见有核分裂细胞，核质比例大；当加入的bFGF 浓度为20ng/ml 时， 24h 即可见到细胞开始伸展，呈多角形、圆形或短棒样，分布比较均匀， 第3-4 天可看到部分细胞呈铺路石样，细胞体积增大，核质比例变小，可见有分 裂核细胞，极少部分细胞呈现双极，多极细胞改变，约一周后，双极、多极细胞 消失，部分铺路石样细胞形成克隆，细胞90%融合。 7 7 4. 在0.3×10 /ml 组和0.1×10 /ml 组， 24h-48h 可见到细胞开始伸展， 呈多角形、圆形或短棒样，分布比较均匀，第5-6 天可看到部分细胞呈铺路石样 改变，细胞体积大，核质比例变小，可见有分裂核细胞，部分细胞呈出现双极， 5 多极细胞改变，约一周后，双极、多极细胞增多。免疫组织化学nestin、NSE 染色阳性，β1整合素、CD34 染色阴性； 0.5×106/ml 组，约3-4 天后可见到散 在的伸展，呈多角形、圆形或短棒样的细胞，大部分细胞一直未伸展； 0.5× 107/ml 组， 24h 即可见到细胞开始伸展，呈多角形、圆形或短棒样，分布比较 均匀，第3-4 天可看到部分细胞呈铺路石样，细胞体积增大，核质比例变小，可 见有分裂核细胞，极少部分细胞呈现双极，多极细胞改变，约一周后，双极、多 极细胞消失，部分铺路石样细胞形成克隆，细胞90%融合。 结论 1.10分钟快速贴壁法可以培养出表皮干细胞，表皮干细胞的特征性标记分子K15 及β1整合素表达阳性，CD34、nestin表达阴性。 3.培养表皮干细胞细胞的最佳培养基为 K-SFM。 4.通过bFGF可诱导表皮干细胞向神经系分化，bFGF对表皮干细胞的诱导具有细胞 密度依赖性。 【关键词】表皮干细胞；分化；神经细胞，；巢蛋白；bFGF 6 英文摘要 Purpose: To investigate the effect factors on differentiate epidermal stem cells into neuron-like cells . Methods:The epidermal stem cells were selected and cultured by rapid attachment to a substrate, th