重组人her2白的纯化及抗her2人源性抗体的初步筛选.pdfVIP

摘要 背景和目的：Her2是一种酪氨酸激酶样受体。在乳腺癌(25％～30 不仅恶性程度高、易转移、预后差，而且由于其介导化疗耐受而治疗效 果差，因此是一种重要的肿瘤标志物。近年虽然开展了一些以HER2为 标志物的诊断，但仅停留在用丁I预后判断的手术切除肿瘤的免疫组化检 已经上市，但其价格昂贵使其使用面大大受到限制。本研究拟制备重组 HER2胞外段可溶性蛋白抗原及多克隆抗体，利用所获抗原构建人源性噬 菌体Fab抗体库，筛选到抗HER2胞外段抗体，为开展HER2表达阳性的 乳腺癌恶性肿瘤的靶向治疗开发具有自主知识产权的基因工程药物，同 时利用所获抗原和抗体筛查乳腺癌等肿瘤病人血清中的抗体和抗原标 志物，为开展对HER2表达阳性恶性肿瘤的早期诊断，指导临床治疗和 预后判断探讨一种新的途径。 方法： pGEX-6P—L中，通过摸索诱导表达条件来提高目的基因的原核表达水平 Glutathlone4B的亲和吸附而纯化。包涵体形式的重组蛋白 Sepharose 溶于8M的尿素溶液中，再用正交设计分析融合蛋白的复性条件。纯化 胞外段重组蛋白。将包涵体作为抗原和佐剂充分乳化，在2个月内免疫 blot ECD蛋白和单抗HER2／neu 来检测抗体的产生及滴度；(3)用重组HER2 胞外区蛋白；(4)分离HER2高表达乳腺癌病人的外周血单个核细胞 EB病毒转化，筛选出 (PBMc)，用纯化的HER2胞外区蛋白体外致敏， 抗原特异性B细胞克隆。抽提永生化的B淋巴细胞的总RNA，RT—PCR扩 增出重链Fd基因和轻链九链及x链的全长基因，先后重组到表达载体 白对噬菌体抗体库进行3轮富集筛选后，挑取20个单克隆制备噬菌体 抗体，用纯化的HER2胞外段蛋白作为抗原检测抗体特异性。 胞外区编码序列一致。重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达 形式存在，但以不溶的包涵体形式为主。低温(30℃)、较高的细菌密 能有利于可溶性融合蛋白的表达，可溶性GST—HER2胞外段融合蛋白的产 mM L-精氨酸， 液(25Tris—C1，0．1MNaCl，10％甘油，lM尿素，0．01M h 复性效果较好，经变性复性纯化的融合蛋白产量可达L829mg／L菌液。 胞外区的效价达1：10000以上的多抗；(4)先期重组的轻链库的重组 率为90％，实际库容为1．13X106，后期重组的重链库的重组率为90％， 108，带轻链和重链Fd段的Fab实际库容量为2．28 实际库容为2．53X X1舻；(5)抗体库经富集筛选后，30个克隆中得到2个抗HER2胞外区 的单克隆，阳性率为6．7％。 结论：(1)低温、较高的细菌密度和适当的培养基添加剂能有利于 可溶性融合蛋白的表达。(2)GST-HER2 ECD包涵体经变性后，可在体外 复性成功；(3)利用GST-HER2ECD包涵体蛋白制备的多克隆抗体滴度 高、特异性良好；(4)制备的重组HER2ECD蛋白和兔抗HER2ECD多克 隆抗体分别可用于病人血清中HER2抗体及HER2ECD水平的检测；(5) 应用体外致敏法和EBV转化联合噬菌体抗体库技术，构建了人源噬菌体 Fah抗体库，初步筛选了抗HER2ECD噬菌体抗体。 关键词HER2，蛋白纯化，多克隆抗体，噬菌体抗体库 Ⅱ AND BACKGROUND OBJECTIⅦHer2 iSone ofproteintyrosine