sedt-pa病基因wisp3突变体在软骨细胞中的表达及功能研究.pdfVIP

盟：￡堂位盐塞 生奎擅要 摘要 第一部分晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病 (SEDT-PA)致病基因WISP3突变体的构建 secreted 3，WISP3) 目的：Wnt诱导分泌蛋白3(Wnt—inducibleprotein tardawith dysplasia progressive 因的表达、定位和功能及SEDT-PA的发病机制奠定基础。 方法：用RT-PCR方法从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因 载体克隆，测序证实后，将它们再分别亚克隆至真核表达载体 切和测序对插入片段进行分析和鉴定。 结果：构建的野生型WISP3基因和突变体的全长cDNA序列分别 实所有的插入片段序列正确。 变体，为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造条件。 关键词： SEDT-PA，WISP3，突变体，定点突变 监主堂位论窑 生塞垴耍 第二部分WISP3基因突变体在软骨细胞中的表达、定位及 其功能的研究 第一章WISP3基因突变体在软骨细胞中的表达和定位 目的：比较观察野生型和突变型WISP3蛋白在人软骨细胞株 C20／A4中表达和定位的差别。 方法：以空白载体pEGFP-C2为对照，用脂质体转染法将带绿色 聚焦显微镜(1aser confocal scanning 的表达和定位。 中荧光均匀分布于整个细胞，转染携带野生型WISP3基因质粒 和聚集现象。 结论：野生型WISP3蛋白定位于细胞浆和细胞膜。突变的WISP3 基因导致其蛋白在细胞浆内异常浓聚可能是SEDT-PA发病的细胞生物 学基础之一。 关键词：SE尹T-PA，w≮3，c20／A4，亚细胞定位 擅±坐位论苫 生奎摘要 第二章WISP3基因突变体在软骨细胞中表达和功能的研究 目的：将构建的WISP3基因突变体稳定表达于人软骨细胞株 C20／A4中，观察WISP3基因突变后在软骨细胞中的功能变化。 方法：以空白载体pcDNA3．1(+)为对照，用脂质体转染法将重组质 粒 、 和 WT-WISP3／pcDNA3．1(+)MUTl000WC／pcDNA3．1(+) 胞增殖和细胞周期测定，用吖啶橙／溴化乙啶活细胞染色(AO／EB)和流 式细胞仪观察细胞凋亡率的变化。半定量RT-PCR测定转染后的各组 type II)，SOX9， C20／A4细胞I、II型胶原(CollagenI，Collagentype MMP．1等基因mRNA表达的变化。用 纤维结合素(Fibronectin)矛N 表达。 结果：半定量RT-PCR和Westernblot显示，各重组质粒在人软骨 细胞株C20／A4中均呈高效表达；转染突变体的C20／A4细胞表现为增 殖速度加快，增殖指数增高、DNA合成增多和凋亡减少，上述改变与 II的表达，而稳定转染突变体质 C20／A4细胞能明显增加Collagentype II的表达无明显改变。 type Collagen 结论：WISP3基因的突变导致其抑制软骨细胞增殖和调节II型胶 III 擅±堂位论室 虫玄擅蔓 原表达等功能的障碍可能是SEDT