乙型脑炎病毒E基因Ⅰ、Ⅱ抗原域片段的克隆与原核表达.pdfVIP

第32卷总第81期 西北民族大学学报(自然科学版) Vd．32。No．1 2011年3月 ofNorthwest forNationalities(NaturalScience) March，2011 Journal University 乙型脑炎病毒E基因工、Ⅱ抗原域 片段的克隆与原核表达 冯若飞1一，李向茸1，韦鹏建1，樊得英1，李明生2，乔自林2，马忠仁2 (1．西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030；2．甘肃省动物细胞工 程技术研究中心，甘肃兰州730030) 对表达的影响，优化反应条件，对表达产物进行SDS电泳和蛋白免疫印迹进行分析．结果通过测序证明重组质粒 正确插入读码框成功。转化至感受态细胞中以包涵体形式表达，37℃时最佳诱导条件的反应条件为1PTG浓度0．6 mmol／L，诱导时间为8h；蛋白免疫印迹显示，重组表达蛋白和单抗、多抗均能进行中和反应。无非特异性表达．表明表 达蛋白具有良好的抗原性。为进一步进行分析E蛋白基因结构与功能的关系、研制新型ELISA诊断试剂和开发基因工 程疫苗奠定了基础． [关键词】乙型脑炎病毒；E蛋白基因；抗原城；克隆；表达 【中图分类号】Q599 【文献标识码】A 【文章编号】1009—210212011)01—0068—05 流行性乙型脑炎(EpidemicencephalitisB)又称日本脑炎(Japanese 种人与动物共患的蚊媒病毒性疾病．该病由黄病毒科黄病毒属B组虫媒病毒中乙型脑炎病毒(Japanese virus，JEv)引起的．目前主要发生及流行于远东及东南亚许多国家和地区，对人类危害巨 encephalitis 大。在中国、日本和其他西太平洋国家中，属于最常见的人类中枢神经系统(CNS)虫媒病之一…． 乙脑病毒呈球形，有包膜的圆形病毒颗粒的直径约为40nm．核心含单股正链RNA，该病毒的完整 基因组全长约11 976 kb(10bp)，沉降系数为40～50S，分子量约为4．2×106Da，整个基因组只有一个 几乎跨越整个基因组的单一开放阅读榧(open frame，ORF)构成，无亚基因组结构．具有一个10 reading 296 432个氨基酸的多聚蛋白前体，该多蛋白前体经蛋白酶切割加工，自5’ bp的ORF编码一个全长3 糖蛋白)和7种非结构蛋白NSl～NS5t引．其中E蛋白是病毒粒表面的重要成分，形成抗原决定簇，能 刺激机体产生中和抗体，保护机体抵抗病毒攻击，与诱导机体宿主的免疫应答密切相关”】．1999年 Kolaskar等…通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测，认为E蛋白含有3个抗原域：域I，也叫中心域， 【收稿日期】2010—11—10 【基金项目】甘肃省中青年科技摹金计划项目(0806RJYA008) ● 【作者简介】冯若飞(1978一)。男(满族)。河北沽源人，助理研究员，硬士，主要从事人畜共患病预防、诊断技术的研究． 一68— 万方数据 水区，具有中和活性和血凝活性抗原表位．98～111区段是黄病毒高度保守区。有一个B一发夹结构；域 白样结构，而且此区域存在中和表位．Wu等【3J、阎丽萍等【5J均证明EⅢ抗原域存在抗原表位，具有中和 位点．但目前对于E工、Ⅱ抗原表位及抗原性报道较少，基于此本研究对EI、Ⅱ抗原域基因进行克隆 并原核表达，通过蛋白质免疫印迹分析抗原性及表达效果，为进一步分析JEV．E蛋白结构与功能、研制 诊断试剂和开发基因工程疫苗提供重要实验依据． 1材料与方法 1．1主要仪器设备 PCR自动系列化分析仪：德国Bametra；Biofuge 温保存箱：日本三洋；YLN2000EDAS凝胶数字成像系统：北京亚力恩；MSC-Advantage1．8生物安全 上海智诚；铝块式恒温槽：日本东京理化． 1．2主要试剂 DNA