代谢活化系统在细胞转化模型中的应用.pdfVIP

中山大学硕I：论文 代谢活化系统在人细胞转化模型-{，的应用 代谢活化系统在人细胞转化模型中的应用 专 业：卫生毒理学 硕士研究生：李文学 导 师： 陈雯教授 中山大学公共卫生学院 中文摘要 随着人类社会的发展，越来越多的化学致癌物进入人们的生活，目前致癌物的检 测方法存在很多不足，促使人们寻找更加敏感、特异、快速的检测方法。细胞转化试 验作为一种化学致癌物检测模型越来越受到人们的重视。 通过人为改变人原代细胞中一些癌基因或抑癌基因的表达，能使其逃脱老化而获 得永生化。尽管这些永生化细胞获得了无限增殖的能力，但没有获得恶性细胞的表型， 在永生化的细胞中继续导入其他的癌基因，最终使细胞发生恶性转化。在转化前的阶 段，细胞并没有恶性表型，而是处于逐渐发牛转化的易感状态，处于此阶段的细胞在 致癌因素作用下比正常的永生化细胞更容易发生转化。因此，我们选取处于转化前期 易感阶段的细胞作为模型，来检测致癌物的致癌活性。 本课题组已经证实，处于易感状态的细胞(高表达犀胁川2和c地c的永生化呼 吸道上皮细胞)对直接致癌物的敏感性比正常细胞高。说明此细胞转化模型对于直接 致癌物的检测有很高的灵敏度。而环境中除了直接致癌物外，绝大部分是间接致癌物， 必须经过代谢活化才具有致癌活性。所以细胞转化模型中必须包括一个代谢系统来活 化间接致癌物。目前，在致癌活性检测中，S9虽然是经典的代谢系统，但存在很多不 足。与S9相比，细胞内的活化系统代谢能力更强，弥补了S9的很多不足。细胞内代 谢包括在细胞中高表达特异性代谢酶和诱导特异性代谢酶的表达。 我们选择永生化人肝细胞，导入第12密码子突变的肛R鲫癌基因，使其处于恶性 中山大学硕J：论文 代谢活化系统在人细胞转化模犁r}1的应用 达和S9，选择具有代表性的间接致癌物黄曲霉毒素BI(AflotoxinBl，AFBl)作用于永生 化和转化前期细胞株，通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验验证在代谢系统 的活化下，间接致癌物诱导细胞转化的作用，探讨活化系统在人细胞转化模型中应用 的可行性，为间接化学诱变物和致癌物的检测提供稳定、操作简便、灵敏度高、特异 度好和更接近人体的活化系统。 研究方法 1．1RAS高表达细胞株L02．R和ST高表达细胞株L02．RST的建立 利用逆转录病毒载体介导的方法在人永生化肝细胞L02的基础上构建癌基因 表达。为了提供与L02．R基因背景接近的阳性对照细胞，L02．R中导入SV40的小T 40smaU fluorescent 抗原(SV antigen，ST)。通过绿色荧光蛋白(greenprotein，GFP) 的表达检测ST的蛋白表达。通过形态学观察、绘制生长曲线以及恶性转化试验观察所 构建细胞株的生物学特性。 1．2．三种代谢系统的建立和评价 1．2．1 S9代谢活化系统的制备和检测 多氯联苯(Polychlorinated 法测定S9的蛋白含量，Ames试验测定S9的代谢活性。 1．2．2 高表达CyPlA2细胞株的建立 白的表达，P450．GLOTM试剂盒测定CYPlA2的酶活性。 1．2．3 AFBl对L02细胞中CYPlA2的诱导效应 AFBl诱导48小时后换成新鲜培养基继续维持培养到96小时，分别在诱 用0．1“M 免疫印迹测定CYPlA2的表达，P450一GLO刑试剂盒测定CYPlA2的酶活性。 巾山大学颂Ij论文 代谢活化系统在人细胞转化模犁11l的应用 AFBI诱导细胞转化实验 1．3．1AFBl染毒浓度的确定： 在相同的染毒浓度下，测定三种代谢系统活化AFBl所引起的细胞毒性。选择其中 毒性最大的IC50的50％、20％和5％作为染毒剂量。 1．3．2细胞转化试验 每周染毒一次，连续染毒四次。染毒后第5周开始每隔两周做一次软琼脂试验，直 至阳性结果出