应用特殊设计的核苷酸链纠正点突变的初步研究.pdfVIP

应用特殊设计的痹核甘睦链纠正点突变的初步研究 中文摘婪 中文摘要 目的：应用特殊设计的寡核苷酸链纠正点突变这一技术是近年发展起来的一 项分子生物学新技术，应用该技术能在基因组碱基序列中任意位点纠正或引入一 个指定的碱基。较之传统的基因重组技术，该技术对基因组本身的结构几乎没有 任何影响，且不会产生因病毒载体和质粒载体引起的免疫反应以及随机整合。一 些遗传性疾病，如乙型血友病，有部分是由于Ⅸ因子核苷酸序列中特定位点点突 变引起的。本研究旨在建立应用特殊设计的寡核苷酸链纠正点突变这一新技术的 体内外研究方法，探讨影响寡核苷酸链的细胞核内转染率以及突变纠正率的因素， 并将该技术初步应用于诱导大鼠肝细胞Ⅸ因子突变，为今后将该技术应用于血友 病等由基因点突变而引起的疾病的基因治疗提供实验依据。 方法：本研究分为三部分，第一部分为寡核苷酸链的化学载体合成。通过减 少孵育时间，以还原胺化法制备低乳糖化水平的聚乙烯亚胺(L—PEI)，采用酚一 硫酸法测定L．PEI中的半乳糖残基含量，计算其乳糖化率。第二部分为体内、外 转染实验。体外实验是将荧光标记的L—PEI与寡核苷酸链复合物分别转染大鼠正 共聚焦显微镜观察比较三株细胞之间寡核苷酸链核内转染率的差异。体内实验则 是将复合物直接注射入SD大鼠肝尾状叶，注射后不同时间观察寡核苷酸链核内转 染率情况。第三部分为诱变实验，分体内、体外两部分。体内实验是将适量的寡 核苷酸链复合物经尾静脉注射入SD大鼠体内，注射后不同时间采血测定凝血功能 指标包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)；提取肝脏DNA， PCR产物测序来验证点突变。体外实验是将寡核苷酸链复合物和细胞孵育一定时 间后提取DNA，PCR产物测序。 结论：通过减少孵育时间，最终成功制备了乳糖化率为6．27％的低乳糖化水 ¨■r_= SMMC．7721三 平的L．PEI。荧光标记的L．PEI．ODN复合物对BRL、HL．7702、 染率较高，与另外两种细胞比较有显著性差异。转染细胞荧光强度定量分析结果 表明，三种细胞平均荧光强度的强弱与其细胞核转染率高低呈相同趋势，提示寡 核苷酸链转运入细胞核的能力在不同种类的细胞之间是有差异的。L．PEI．ODN与 应用特殊世汁的寡核甘陵链纠正点突变的初步{ifF究 中文摘要 PEI—ODN分别转染三种细胞后核内荧光强度均呈显著性差异，L—PEI—ODN组 的核内荧光强度显著高于PEI．ODN组，显示出载体乳糖化后的优势。体内24h转 染率较低，且荧光物质大多聚集在肝管周围，没有充分分散。48h则比较分散，寡 核苷酸链肝细胞核内转染率达到5％。体内诱变实验中，低剂量和高剂量实验组 SD大鼠凝血功能指标PT、KPTT与对照组比较均无显著性差异，测序结果也证实 了没有突变被诱导。 关键词： 寡核苷酸链：基因定点突变：点突变；聚乙烯亚胺；血友病B 作 者：杨汝艳 指导教师：田海林副教授 麻用特昧殴计的寡核苷睦链纠正点突变的棚步研究 英文摘要 onthe of PointMutation Study technologyCorrecting by SpeciallyDesignedOligonuc