微丝相关新基因HBrk1的克隆及功能鉴定.pdfVIP

微丝相关新基因hHBrkl的克隆及功能鉴定 摘要 细胞形态的变化可影响细胞内大分子的代谢。细胞骨架对于细胞形态的维持起着主 导作用，细胞表面的接触和细胞形态的改变，都是通过细胞骨架成分，把信息传导至核 内而引起细胞一系列生物化学反应。微丝为直径6nm的细丝，是细胞骨架的成分之一。 微丝在细胞形态和运动的调节蛋白与执行蛋白之间，搭建起一机械支架结构，参与维持 细胞的形态、肌肉收缩、细胞运动、物质运输等生命活动，另外完整的微丝骨架是细胞 内源性信使协调作用的基础。 在恶性转化的细胞中，细胞常表现为细胞骨架的破坏和微丝的异常聚合。肿瘤细胞 的浸润、转移与微丝及其相关蛋白的表达改变有关，微丝的异常聚合可增强肿瘤细胞 的运动能力。因此深八研究肿瘤浸润、转移的机制，寻找新的肿瘤运动相关基因，可为 肿瘤的生物治疗提供治疗靶点。本研究室以永生化人支气管上皮细胞BEP2D和恶转的 BEPR35为研究对象，采用抑制性削减杂交和基因芯片技术，筛选到一在肿瘤中高表达 GsTpull—down、免疫共沉淀等技术，克隆了该基因，将之命名为^觑，以』，并对其功能 进行了初步鉴定。实验分三部分内容：1，^瑚船』基因的克隆和生物信息学分析；2． hHBRKl蛋白的细胞定位研究；3．hHBRKl相互作用蛋白的鉴定。 第一部分hHBrkl基因的克隆和生物信息学分析 应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，从人的胎脑炙库中克隆了^瑚r≈，基固， ^船，t，基因位于3号染色体短臂的25．3．24．1区，由3个外显子和2个内含子组成，编 码75个氨基酸，分子量约9KD。Nonhem印迹杂交结果表明，斛加以』基因在人体12 种正常组织中均有表达，尤以心肌和骨骼肌为著。在人的胎脑、胎肝、胎肺和胎肾组织 Kb 中表达丰度相似。同时Northem印迹杂交显示^瑚，女』基因有2个转录本，分别为1．1 和1．4Kb，与RACE的结果相符。 hHBRKl蛋白家族保守性很强，与小鼠的同源蛋白只有1个氨基酸的差异，同源性 达98％，与植物界相关蛋白的同源性迭35％，提示hHBRKl蛋白为一在动植物界高度 (heptad 其中“a”和“d”位上的氨基酸均为疏水性的亮氨酸、异亮氨酸或其他疏水性的氨基酸。 如肌球蛋白、肌钙蛋白等共有的结构域，可与其他有此结构的蛋白形成异二聚体，或本 身形成同源二聚体。 第二部分 hHBRKl蛋白的细胞定位研究 采用绿色荧光蛋白(GFP)报告系统，转染具有高转移潜能的大细胞肺癌细胞株 95D，荧光显微镜下观察到hHBRKl蛋白在细胞间期定位于细胞浆，并且在细胞运动前 的分布，重新定位于细胞膜皮质区和缢缩环。利用TRjTC标记的鬼笔环肽显示微丝， 激光共聚焦技术显示，hHBRKl蛋白与微丝蛋白在细胞运动的最前沿有共定位，提示 hHBRKl蛋白为一微丝相关蛋白，可能参与微丝的聚合。 为进一步研究hHBRKl蛋白的特异定位，本实验设计了一系列缺失和突变体。分别 水性的精氨酸(11HBRKlR”)，另一突变体位点在第56位的亮氨酸和第57位的丙氨酸， 构建了pGFP也HBRKls”G57载体。将质粒转染95D细胞，荧光显微镜下发现： 但在细胞中呈弥散分布，并在一细胞器中富集。本实验用高尔基复合体探针ceromide 内物质的运输有关。GFP．姐BRKls56G57和ll}{BRKlR54蛋白在细胞浆中弥散分布，失 去了在细胞前沿富集的特征，提示HR结构域在微丝的聚合过程中发挥着重要作用。 看到ARP3蛋白在细胞浆中呈点状分布，在细胞运动前沿富集不明显，在胞浆中局部有 高亮点，ARP3蛋白亮点与微丝蛋白共定位，提示在95D细胞中存在异常的聚合。^册rt， 提示虽然二者均参与微丝的聚合，但它们之间存在一定的空间位置。 第三部分hHBRKl相互作用蛋白的鉴定 为了探讨hHBRKl蛋白的作用机制，本研究采用GsT B10t和免 pull—down、westem 2 纯化，得到GsT_hHBRKl融合蛋白。选择小鼠的心肌为研究对象，应用GsTDull一down 的方法，得到了一hHBRKl