深圳地区C组轮病毒和G1型小双节RNA病毒的分子进化分析.pdf

深圳地区C组轮状病毒和G1型小双节RNA 病毒的分子进化分析 硕士研究生：赵德坚 指导老师：胡贵方教授 何雅青研究员 摘要 研究背景 世界卫生组织的数据显示全球每年有80万小于5岁的儿童死于腹泻疾病。 在我国，2010年全国报告感染性腹泻病例74万例，而病毒性感染占实验室确诊 病例的92．7％。A组轮状病毒、人星状病毒、人杯状病毒和肠道腺病毒是常见的 腹泻病原体，凸隆病毒、冠状病毒、C组轮状病毒、小双节RNA病毒等也逐渐 被确定为腹泻的新发病原体，其中C组轮状病毒和小双节RNA病毒在全球范围 内广泛地被检出，且两者皆为节段型病毒，容易发生重配和重组，危害较大。 深圳市外来人口众多，病毒发生基因交换的可能性高，且目前深圳地区尚未检 出这两种病毒，研究意义重大。 CRotavirus，GCRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒 C组轮状病毒(Group 属，可以引起人类和动物急性胃肠炎，全基因组包括11个节段的双链RNA，编 GCRV在全球范围均有检出，其宿主有人、猪、牛、狗、鸡。GCRV主要引起腹 泻的散发流行，目前仅在日本、中国和英国出现过暴发疫情的报道。全球的血 清学监测显示，各国的人群GCRV感染率为33％～39％，以老年人群的感染率 中文摘要 最高。相对城市地区而言，农村的GCRV感染，年龄越小且感染率越高。除VP 3基因外，人类GCRV所有RNA片段均高度保守，其中VP6基因之间的同源性 最高，非结构蛋白编码基因同源性稍低。GCRV的不同种类株的混合感染多有报 道，提示GCRV可能突破物种限制，能在人、猪、牛之间实现跨种传播。不同 组的轮状病毒(Rotavims，RV)的共同感染不仅可能造成RV组问的基因转移， 且会加大对肠道的伤害。与GARV引起的重症腹泻相比，GCRV引起的症状比 较缓和，但人GCRV可能造成婴幼儿等不同人群的肝外胆道闭锁，而牛GCRV 可能造成奶牛的减产，对人类的健康和经济都有不利的影响。 双链RNA病毒，大的节段基因编码衣壳蛋白、而小的节段基因编码依赖RNA 的RNA聚合酶。PBV的宿主为包括人类在内的各种不同的脊椎动物。自从在1 988年的一起儿童急性胃肠炎暴发中的腹泻样品中偶然检出以来，PBV在腹泻疾 病的作用引起了研究者的关注。在非腹泻的健康宿主中，PBV也可被频繁检出， 有研究推测PBV可能是免疫不全个体的机会致病菌。PBV的早期检测主要是P AGE-SS法，分为大基因组型和小基因组型。以两个原型株(1型的GGUPBV／h 编码RdRp区域的保守片段设计引物对，有效性在世界多个研究中得到验证。P BV在多个国家的人类粪便样品中检出，从低至O．09％到13％不等。目前从粪便 5％是关于GI型PBV，提示GI型PBV一直是优势株，但也可能是GII型的引物 对的检测能力不足。目前采用的系统发育研究没有显示任何基于地理分布上的 聚类，提示PBV的普遍存在和同时传播。猪PBV都属于GI型，提示PBV可能 作为准种存在，在系统发育分析显示，猪PBV与人PBV相关，人PBV也与猪 PBV有关系，跨种属传播的可能很大。早期研究显示，没有发现核苷酸序列相 同的PBV株，来自相同地理位置上的分离株，比起来自一些急性胃肠炎爆发的 分离株，它们之间的关系更为紧密。后来，在加尔各答的腹泻小马的身上检出 马PBV，它却与相同地域的人PBV共有完全一致的序列，且与匈牙利报道的猪 PBV的同源性紧密相关。 研究方法 收集2011年和2012年深圳腹泻哨点监测系统的腹泻疑似样品，经过样品 的预处理、RNA的提取后，分别采用荧光实时PCR和RT-PCR筛查C组轮状病 毒和小双节RNA病毒，分离得到的C组轮状病毒阳性株，通过17对特异引物 对扩增C组轮状病毒的全基因组序列；小双节RNA阳性株仅扩增GI型特异片 段。对扩增的GCRV特异片段双向测序，拼接序列。从GenBank数据库中分别 下载包含完整编码序列的ll节段的GCRV同源序列和GI型PBV的同源序列， 并采集关于序列的信息。寻找最优的核苷酸替代模型，采用最大似然法，重构 基因的最大似然树。通过BLAST检索，了解与检出的GI型PBV分离株最为相 关的序列信息。构建核苷酸相似性和氨基酸相似性