用4对引物聚合链式反应检测鼠疫耶尔森氏菌的试验研究.pdfVIP

— 一一一一一一一一 乞主鱼 共 _ 用4对引物琅合蔺链式反应检洲砚咬耶尔森氏， 的试脸研 摘 要 目的:鼠疫是甲类一号传染病，发病急、传播快、病死率 高。鼠疫的传播主要是通过蚤的叮咬由宿主动物传播到人或 通过空气飞沫在人与人之间传播。鼠疫的病型分为9种类型， 尤其肺鼠疫、败血型鼠疫最为严重，在不治疗的情况下，死 亡率几乎100%0鼠疫的诊断一直沿用19世纪50年代发展起 来的 “四步检验法’，，即显微镜检查、细菌培养、鼠疫噬菌体 裂解试验、动物试验，从宿主体内分离到鼠疫耶尔森氏菌为 目的，这样就可根据鼠疫耶尔森氏菌的特征来判定宿主是否 感染鼠疫。血清学通过吸附在绵阳红血球上的特异性抗原与 鼠疫菌特异性抗体发生反应，使红血球凝集。但是这些方法 存在着繁杂、费时等诸因素的影响，往往给鼠疫的诊断带来 困难。 鼠疫PCR技术是1995年由中国鼠布基地引进，并在部分 省区开展的分子生物学技术，它是一种利用鼠疫耶尔森氏菌 特定的引物对特异的DNA片断进行体外扩增的检验方法。目 的基因往往选择鼠疫耶尔森氏菌特异的质粒。但是鼠疫耶尔 森氏菌在自然条件下容易发生变异而变成 “非典型菌”，这时 通过一对或两对引物PCR的方法检测不到菌。本文利用现在 公认的三对质粒基因和一对染色体基因作为靶基因来检测鼠 疫耶尔森氏菌，全部实验在4h内全部完成，克服了 “四步检 验法”必须在24-48h才能完成所带来诊断困难。从而探索一 中丈摘 丢 种鼠疫的快速诊断方法。 方法:1所用菌株是我省自19世纪50年代以来分离于 河北鼠疫自然疫源地的菌株，菌株保存于真空冻干管中，颜 色为淡白色。首先对菌株复活，28℃培养48h，再经过1-2代 使菌株复活。 2 我们对鼠疫耶尔森氏菌的本底信息进行鉴定，包括糖酵解 试验、生化试验和毒力因子的鉴定。糖酵解试验用液体汤管 法，生化试验用固体试管法，毒力因子的鉴定采用文献所介 绍的方法。 3 动物模型选择河北省鼠疫自然疫源地主要传播媒介突病 蚤蒙冀亚种蚤，首先在疫源地收集新鲜的鼠巢进行羽化，分 类鉴定后，把突病蚤蒙冀亚种蚤单独饲养用于实验材料。首 先在控制条件下，盯咬感染鼠疫耶尔森氏菌的小白鼠，然后 把小白鼠取出单只拣蚤。材料研碎分成 2份，一份用于四步 检验、一份用于鼠疫PCR. 4 对引物的合成通过internet从DD叮核酸网检索并设计。 目的基因选择编码FI抗原的质粒caf1基因、编码血浆凝固 酶及胞浆素原活化因子的质粒pla基因、编码与色素沉着有 关的hms基因以及染色体inv基因。PCR反应采取标准的反应 体系加入，然后按950C5min，再按95Clmin,540Clmin,72 ℃lmin30次循环，最后720C5min。反应物经0.8%琼脂糖凝胶 电泳 30min，再在含 0.5%的澳化已咙的容器中染色 30min，分 析、成像。 结果:2003年3-5月在河北省自染疫源地共收集鼠巢146 个，羽化蚤 746匹，其中突病蚤蒙冀亚种83匹。菌株的鉴 定出现与文献相同的特征[[3]。四步检验的结果在83份材料中 中文摘要 __ 共有 62份出现阳性结果，检出率为 79.9%，全部实验要在 24-48h才能完成。4-primer-PCR的结果有73份出现预期的 扩增带，而且试验证明四对引物互不影响，按着自己的复制方 式扩增出PCR的产物，全部实验在4h内完成。敏感性经统计 学处理没有显著性差异。 结论:4对引物鼠疫PCR法具有快速、特异、敏感等 优点，可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。 关健词:4对引物 聚合酶链式反应 鼠疫耶尔森氏菌 快速诊断 英 文 摘 要 StudyOnDetectionOfYersiniaPestisBy PolymeraseChainReactionUsing4PairsOfprimer ABSTRCTION O坷ective:Plague,thefirstinfectiousdiseaseinGroupeA, spreadsquicklyandhashighm