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肝细胞凋亡模型的建立及中药干预作用的研究 摘要 ∞矽：肝细胞体外培养技术为肝病及相关学科的研究提供了重要 的实验方法，但能够合理地利用此项技术并非易事。肝细胞凋亡 与肝病的发生、发展及转归密切相关。本研究对不同来源肝细胞 的分离、培养方法进行了探索与比较，在此基础—呀0用大鼠肝细 胞从细胞凋亡的角度探讨了自组中药复方制剂的保肝作用机制。 ／1．不同来源肝细胞培养的比较 ＼本研究对正常成年Wistar大鼠、Wistar大鼠乳鼠及人胎肝 细胞进行了培养，并从分离方法、形态、活力、功能及存活时间 等方面进行了比较。分离方法：成年大鼠稠先灌注后体内胶原 酶消化的简易灌流法，乳鼠采用体外胶原酶预处理的组织块培养 法，人胎肝采用先灌注再体外胶原酶处理的培养法。细胞形态： 三种来源的肝细胞基本相似，属典型上皮样细胞，经培养后胞浆 内出现颗粒、腊滴及空泡；入胎肝细胞体积介于成年大鼠与乳鼠 肝细胞之间；分离所得肝细胞的活率(台盘蓝染色法)彼此间存 在显著差(P如．05)，大鼠为89．0±3．4％，乳鼠为29．04-4．4％， 胎肝细胞为56．2-+-4．8％。生长活力(Mrr法)：经胶原酶消化 所得肝细胞在不同培养时间、不同组别间MTr的OD值存在显 著差异(Po．05)，但从时效曲线上看，成年大鼠肝细胞在培养 3天时有一峰值，而人胎肝细胞在培养5天后出现“平台期”。 白蛋EI(ALB)的分泌量：经胶原酶消化所得肝细胞在不同培养时 间、不同组别间存在显著差异(P锄．05)，反应在时效曲线上， 成年大鼠肝细胞于培养3天时有一峰值，而胎肝细胞则在培养5 天后出现“平台期”；组织块培养所得肝细胞在不同培养时 间、不同组别间也存在显著差异(P如．05)，从时效曲线上看，乳 鼠组织块与人胎肝组织块所长出的肝细胞ALB分泌量都呈递增 趋势，均有“平台期”出现，但后者升高更为明显。存活时间 及传代培养：大鼠肝细胞在体外存活7天，乳鼠与人胎肝细胞体 外生存时间较长；相同条件下乳鼠肝细胞可传至5代，而人胎肝 细胞传代显得困难。以上结果提示人胎肝细胞无论生长活力还是 蛋白合成均最佳，乳鼠肝细胞次之；乳鼠肝细胞较人胎肝细胞易 传代；成年大鼠肝细胞来源广泛，操作方便，但在体外存活时间 较短，适宜于一般短期基础实验。 2．TNF-a诱导正常肝细胞凋亡的实验研究及中药的保护作用 本实验用TYF-a诱导正常成年大鼠肝细胞作为凋亡模型， 从细胞凋亡的角度在细胞水平对自组中药复方的保肝作用机制进 行了探讨。实验分组分别为空白对照组、凋亡模型组、中药组 (O．2ugjn-a)的肝细胞生长活力(MTF法)与空白对照组相近 (Po．05)，明显高于凋亡模型组(P0．05)，其他两中药组与凋 亡模型组相比无显著差异(Po．05)，却明显低于空白对照组 (P如．05)。荧光染色可见空白对照组中几乎全为黄绿色的正常 肝细胞，凋亡模型组中凋亡肝细胞多见，各中药组凋亡细胞数介 于两者之间，药物浓度越低，凋亡细胞数越少。．电镜观察可见凋 亡肝细胞体积缩小，染色质固缩，聚集于核膜下呈境界分明的块 状或半月形小体，细胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的凋亡小体。琼 脂糖凝胶电泳可见凋亡模型组与中药组(20ug／rra)出现清晰的 DNA梯状条带，而空白对照组和中药组(O．2ug／n[1l、2ug／m1)则 没见或不明显。流式细胞术分析可见空白对照组凋亡率明显低于 其他各组(P妯．05)，中药组(O．2ug／ml、2ug／m1)的凋亡率低 于凋亡模型组(P0．05)，中药组(20ug／m1)的凋亡率与凋亡 模型组相近(Po．05)。延长培养时间至72小时，观察各组在 不同时间白蛋白(ALB)分泌量的变化，结果显示：24小时 后，空白对照组ALB分泌量远高于其它各组OⅫ．05)，与凋亡 模型组相比，中药组(2ug／m1)分泌量稍高(P如．05)，中药组 异(P0．05)；48小时后，空白对照组ALB分泌量仍高于其它 各组(p0．05)，但各中药组明显高于凋亡模型组(Po．05)；72 小时后，空白对照组ALB分泌量还高于其它各组(P0．05)， 中药组(0．2ug／m1)的ALB分泌量明显高于凋亡模型组 于凋亡模型组(P铷．05)。以上结果提示此中药复方能够抑制 n吓-a诱导的肝细胞凋亡并促进正常肝细胞ALB的分泌。／ 结论：1．应根据不同的实验材料、实验条件选择合适的肝细 胞分离培养方法。2．细胞水平以肝细胞凋亡为观察指标探讨了自 组中药复方制剂的保