金属硫蛋白（M-I）真核表达载体的构建及其对重金属镉细胞毒性的影响.pdfVIP

金属硫蛋白(MT—I)真核表达载体的构建及 其对重金属镉细胞毒性的影响 硕士研究生： 邹铁 指导教师： 仲来福教授 专业名称： 劳动卫生与环境卫生学 摘 要 糠铺是一种对环境污染比较严重的重金属，广泛的应用于电 镀、染料、电池、合金等工业生产中。镉在环境中非常难以降解，在 生物体内也难以捧出，生物半减期可长达8—30年，为已知的最易在 体内蓄积的毒物之一。镉对人体的危害极大，急性的镉中毒可导致肝、 肺和睾丸的损伤。而慢性的镉中毒则主要损伤肾脏、骨骼及免疫系统， 甚至引起癌变。目前为止，关于镉中毒的机制并不十分清楚，多数学 者认为肾脏是镉作用的主要靶器官，镉的毒作用与氧化应激有关。 富含半胱氨酸的金属结合蛋白。具有结合重金属、清除自由基、拮抗 电离辐射等多种生物学功能，并与机体多种疾病的发生和发展有着密 切的关系。现在研究认为哺乳动物体内MT分为MT—I、耵一II两种， 分别由不同的基因所表达。MT的合成可被镉等多种金属离子所诱导， 并与之有着较强的结合能力，故在镉的毒性损伤中发挥着重要的作 用。 ，，、 、～、(本实验选用转染了Balb／c小鼠MT—I cDNA的大鼠肾细胞系(NRK) 作为研究对象，旨在探讨镉毒性损伤的机制及MT在其中的作用，并 为进一步的寻找镉毒性的预防及治疗方法做准备。 方法 将Balb／c小鼠的MT—I V位点，构建了正向插入MT一1基因的表达载体，并将其导入NRK细 胞内，用含G418的选择性培养基筛选出MT的阳性克隆，同时利用镉 一血红素法检测细胞MT的表达量。为了研究MT对cd2+所致细胞毒性 的影响，使用不同浓度的CdCl：作用转染MT—I基因的细胞和转染空载 体的对照细胞，以叭T法观察细胞损伤后4h、8h、lZh、24h的存活 率，并计算50％的生长抑制浓度(IC。。)。在电镜下观察1．OmM的CdCl： 作用4h后细胞形态的变化。 全一致。利用PCR技术在转染MT-I基因的NRK细胞基因组中扩增出 了特异的300bp条带，证明转染是成功的。MT在转染细胞组和空白对 照组中的表达量分别为17．90和7．97ug／107细胞。两者具有显著性的 差异，证明岍在细胞中获得了较高的表达。根据MTT的结果，CdCl： 可引起非常明显的细胞损伤。损伤程度随CdCl：浓度的增加和作用时 z所引起的细 间的延长而加重，表现为细胞存活率的下降。MT对CdCl 胞急性损伤有着明显的保护作用，在4h、8h、12h时转染MT细胞组 CdCl：所致细胞损伤的早期阶段保护作用明显，随着作用时间的延长保 护作用逐渐减弱。电镜观察发现，对照组细胞呈明显的坏死样改变， 线粒体表现为特征性的电子密度增高，转染组细胞形态完整，细胞膜 未见明显改变。线粒体结构基本正常。丫 结论MT对CdCl，引起的细胞损伤饷早期阶段有着明显的保护作 用．其机理可能为MT与Cd2+结合形成Cd—MT复合物，从而减轻了游 离C扩+对细胞的损伤，特别是对细胞线粒体的损伤。同时盯可以直 接清除CdCl：诱导细胞产生的氧自由基。但这种保护随作用时间的延 长而减弱。可能是由于Cd-MT复合物本身也可以通过脂质过氧化等方 式损伤细胞。关于MT与镉所致细胞损伤的关系，国内外已有文献报 道，但至今并未得出一个明确的结论，本研究有助于丰富关于镉毒性 作用机理的研究，并为更好的预防和治疗镉中毒提供试验依据。 关键词： 镉 金属硫蛋白 细胞毒性氧化应激 Constructionof MT—I Eukaryotic Expressive Vector and ItsEffect on