铝致神经细胞凋机制的体外实验研究.pdfVIP

山西爰拜大学硬士学位埝文 中文摘要 目的通过体外培养大鼠神经细胞并用不同浓度氯化铝染毒，在细胞水 乎上研究铝致神经细胞凋亡的分子机制。方法采用颞生l一3天的SD大鼠， 在无菌条件下取出脑皮质并用0．25％胰酶消化，以l×105密度接种神经细胞。 用A1C136H20分别对神经细胞染毒，分为对照组、低剂量组、中剂量组、高 mM／L、1．0mM／L、2．0 剂量组，傻其终派度为0mM／L、0．5 mM／L，继续培养 48h，观察细胞的生长状况并测定其生化和分子生物学改变。①光镜、电镜、 荧光染色积TUNE乙法观察裤经细胞的形态学变化，并局流式细腿术定量检测 神经细胞的早期、晚期及总凋亡率。②透射电镜观察线粒体的形态学改变并 检测线粒体的膜标志酶和ATP酶活力，用westemblot法测定凋亡相关蛋白 CtyC和Caspase一3的含量变化。③透射电镜观察内质网的形态学改变并检测内 质网的脂质过氧化水平，用westernblot法测定凋亡相关蛋白CtyC和 白及基因的含量及表达情况。结果①光镜下可见凋亡细胞体积缩小，染色 质致密聚集成斑块状，铝剂量的加大可以明显减少神经元的轴突和树突的数 量、缩短突触长度和减少神经元细胞问秘细胞与突触闽的连接。相差显微镜 下可清楚地观察到凋亡细胞的发泡和凋亡小体。透射电镜下也可以见到凋亡 缀魁的特征链变化，扫描电镜更加直接她观察到猖亡鳃飓表面泡状突起的形 成。吖啶橙(AO)一溪化乙啶(EB)双荧光染色法可以清楚地观察到细胞的早期 凋亡和晚期凋亡现象，并随着染铝剂量的加大可见TUNEL法DNA碎片绿染 颗粒逐灏增多。流式细腿术定量检测结果显示，缨胞豹早期、晚期和总凋亡 率均随着染铝剂量的加大而升高(p‘O，01，r为0．878，0．927，0．976)。②透射电镜 观察线粒体的形态学改变发现，凋亡细胞线粒体的结构变化主要是肿胀．并 可伴有线粒体嵴数减少或消失。肿胀重者呈气球样变和空泡化。线粒体的肉 膜标志酶琥珀酸脱氢酶(SDH)、外膜标志酶单胺氧化酶(MAO)及 ca2+．M孑+鲥P酶、Na+．CATP酶活力检测结果显示，各酶的活力在低刹量染 毒组均有显著升高(p0．01)，但随着染毒剂量的加大，在中高剂量组逐渐下 降，且在高剂量染铝组各酶的活力均较对照组显著降低(p0．01)。检测线粒 体凋亡糨关蛋白CtyC和活性caspase一3的含量变化发现，胞浆期线粒体中的疆 I 山西医科大学焉士学位融立 浆中的含量很低，在线粒体中的含量较高，随着染铝剂量的增大其在胞浆中 的含量增加，在线粒体中含量则减少，蛋白含量在各染毒组问的差别无统计 学意义(pO，05)，而且染铝后cytc在线粒体内的含量显著低于在胞浆中的含 量(p0．01)。③透射电镜观察内质网的形态学改变发现染铝内质网肿胀变形， 呈囊泡样扩张，粗面内质网有脱颗粒、肿胀现象。内质网的脂质过氧化水平 检测结果显示，超氧化物岐化酶(SOD)的活力在染毒的低剂量组有显著升岛 (p‘O．01)，随染毒剂量的加大逐渐下降；丙二醛水平(MDA)则在染毒的低剂 量组有显著下降(pO．01)，随染毒剂量的加大逐渐上升。Na十一K+ATP酶和 c2+．Mg”ATP酶的活力也在染毒的低剂量组有显著升高(po．01)，随染毒剂 量的加大而逐渐下降。内质网的凋亡相关蛋白Ctyc和caspase．3的含量检测结 果显示，活性caspase-3的含量随染铝剂量的增加而上升，中高剂量组与对 照组相比差异有统计学意义(pO．01，r=0．902)，而CtyC仅在对照组含量较高， 在各染铝组的含量均很低，各剂量组与对照组相比差异均有统计学意义 蛋白的免疫组化测定结果显示，Bcl．2蛋白在对照组中含量最高，且随染铝剂 量的加大而逐渐下降00．01，产．0．695)；反之，Bax蛋白在对照组中含量最低， Bcl．2／Bax的比值也逐渐下 随染铝剂量的加大而逐渐上升(pO．01，r0．676)： 在对照组中表达较强，而bax卿J表达较弱，随着染铝剂量的加大bcl．2的表达